יציקת שרף מערכת המרה: טכניקה לניתוח ארכיטקטורה תלת ממדית של מערכת המרה במודל מורין באמצעות הזרקת שרף רדיופאק

תקציר

מקור: Hankeova, S. et al. DUCT: יציקת שרף כפול ואחריה טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת לניתוח כבד תלת-ממדי. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מתאר את הליך יציקת שרף מערכת המרה, להבנת ארכיטקטורת מרה תלת ממדית. טכניקה זו מספקת תובנות לגבי הקוטר הפנימי וקישוריות הרשת של מערכת המרה, אשר יכולה לשמש לניתוח התחדשות הכבד.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הזרקות שרף כפולות

1. הכנה
   1. הכינו תמיסת שרף. להזרקות שרף כפולות, הכינו שרפים צהובים וירוקים כמתואר בשלבים 1.1.2-1.1.4.
   2. הכן 1 מ"ל aliquots של שרף מדולל לכל עכבר.
   3. שרף צהוב: מדללים גומי סיליקון צהוב (רדיופסיטי גבוה) עם המדלל השקוף בדילול 3:1 כדי להכין את השרף הצהוב להזרקה.
   4. שרף ירוק: מערבבים גומי סיליקון כחול (רדיופסיטי בלתי ניתן לגילוי) עם המדלל השקוף בדילול 1:1 להכנת שרף כחול. כדי ליצור שרף ירוק, ערבבו את השרף הכחול המדולל עם השרף הצהוב המדולל ביחס של 1:1. מערבבים היטב את השרף הירוק עד שהצבע הומוגני.
      הערה: לשרף הכחול יש רדיופסיביות נמוכה מאוד שאינה ניתנת לגילוי עם microCT, ולכן מחייבת דילול עם שרף צהוב כדי ליצור שני שרפים עם radiopacities שונים.
      זהירות: שרף עשוי להכיל כרומט עופרת, שהוא חומר מסרטן. הוא מייצר גזים רעילים בשריפה. יש לטפל בזהירות ולסלק את השרף כפסולת מסוכנת.
   5. הכינו שתי ערכות הזרקה (סט הזרקות #1 וסט הזרקה #2) עם צינורות כמתואר בשלבים 1.1.6-1.1.11.
      הערה: עבור עכברות בוגרות (>P30 (יום 30 לאחר הלידה) = P30 - שנתיים), השתמש בסט הזרקה #1 (צינורות PE10 בקוטר חיצוני של 0.6 מ"מ) להזרקה משותפת של צינור המרה וסט הזרקה #2 (צינורות PE50 בקוטר חיצוני של 0.96 מ"מ) להזרקת וריד פורטלי. עבור עכברות צעירות לאחר הלידה (עד P30), הכינו שתי ערכות הזרקה #1, אחת לצינור המרה ואחת להזרקת ורידים פורטליים (ללא סט הזרקות #2 מכיוון שווריד הפורטל צר מכדי להכיל צינורות PE50).
   6. כדי להכין סט הזרקה #1, חתכו 30 ס"מ של צינורות PE10 ומתחו קצה אחד של הצינור ביד על ידי משיכתו עד שהוא הופך דק ככל האפשר (איור 1A,B, קוטר 0.15 מ"מ בקירוב, צינורות PE10 לא מתוחים בקוטר 0.6 מ"מ).
   7. חתכו את קצה צינור PE10 המתוח באלכסון כדי ליצור קצה משופע (איור 1B).
   8. חברו את הקצה הלא מתוח של צינור PE10 למחט של 30 גרם (איור 1A, ערכת הזרקות #1).
   9. כדי להכין סט הזרקה #2, חתכו 30 ס"מ של צינורות PE50 ומתחו קצה אחד של הצינור ביד על ידי משיכתו עד שהוא נעשה דק מספיק כדי להתאים לווריד הפורטל (איור 1A,B, בערך 0.7 מ"מ, צינור PE50 לא מתוח הוא בקוטר 0.96 מ"מ).
   10. חתכו את קצה צינור PE50 המתוח באלכסון כדי ליצור קצה משופע (איור 1B).
   11. חברו את הקצה הלא מתוח של צינורית PE50 למחט של 23 גרם (איור 1A, סט הזרקות #2).
       הערה: כל סט הזרקות יכול לשמש רק להזרקה אחת מכיוון שהשרף יתקשה במזרק ובצינור. התאם את גודל הקצה המתוח והמשופע בהתבסס על גודל צינור המרה המשותף ווריד הפורטל של העכבר, בהתאם לגילו, הגנוטיפ והפנוטיפ שלו. כאשר אינך בטוח לגבי גודל והתאמת הצינור, הכנס את הצינור לצינור או לכלי המתאים לאחר החתך ולפני שהצינור מלא בשרף. אם הצינור רחב מכדי להתאים לצינור/כלי, מתחו אותו עוד יותר.
   12. מרדימים את בעל החיים על ידי שאיפת איזופלורן (4% ראשונים בתא האינדוקציה ו~2% באמצעות חרוט האף).
   13. הניחו את העכבר על ספסל מאוורר על כרית דיסקציה בזמן שהעכבר נושם איזופלורן דרך חרוט האף. ודא כי בעל החיים מחוסר הכרה על ידי מכון / שיטה המומלצת IRB, למשל, על ידי צביטה אחת הכפות.
       זהירות: איזופלורן עלול לגרום לנמנום או סחרחורת בשאיפה ועלול לגרום נזק למערכת הלב וכלי הדם ולמערכת העצבים המרכזית באמצעות חשיפה ממושכת או חוזרת. אין לשאוף אותו. יש לטפל בחומר על ספסל מאוורר ובאזורים מאווררים היטב.
       הערה: ניתן להשתמש בשיטת הרדמה אחרת, כל עוד היא תואמת זילוח לב.
   14. ברגע שבעל החיים מאבד את הכרתו, רססו את הצד הגחוני באתנול 70% כדי למנוע הפרעה מפרווה.
   15. בעזרת מספריים לעור, חותכים את העור, הפאשיה ושכבת השרירים החל מקו האמצע של חלל הבטן וחותכים עד לחלל בית החזה כדי לחשוף את האיברים הפנימיים.
   16. תפוס את תהליך הקסיפואיד עם מלקחיים כדי להרים את עצם החזה וחתך את הסרעפת וכלוב הצלעות משני הצדדים כדי לחשוף את הלב והריאות.
   17. הסר את כלוב הצלעות על ידי חיתוך דרך הצלעות בצד שמאל וימין של כלוב הצלעות עם מספריים. היזהר במיוחד לא לפגוע בכבד כמו זה יגרום דליפה של שרף.
   18. בעזרת מלקחיים ישרים, מושכים את הלב לכיוון הכבד וחותכים את האטריום הימני.
   19. החדרת מחט פרפר (23 גרם), המחוברת למשאבת זילוח פריסטלטית, לחדר השמאלי. לערבב את העכבר באופן טרנסקרדילי עם תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) והפרין (1 U/g ממשקל גוף העכבר). מחורר למשך 3 דקות עם קצב זילוח של 5 מ"ל/דקה
       הערה: אם העכבר מחורר כראוי, האיברים הפנימיים יהפכו חיוורים, במיוחד הכבד. אם, במקום זאת, הריאות הופכות לבנות, המחט מוחדרת לחדר הימני ויש למקם אותה מחדש. לאחר זילוח, העכבר הוא exsanguinated וניתן להסיר מן חרוט האף isoflurane.
   20. כבו את משאבת האיזופלורן.

2. הזרקת שרף - יציקת שרף במערכת המרה

1. הזיזו את העכבר למיקרוסקופ הדיסקציה, הבטן למעלה, הזנב לכיוון הנסיין והתרחקו מהנסיין. ציוני הדרך האנטומיים המעניינים מתוארים באיור 2A.
2. אתרו את הווריד הנבוב התחתון (איור 2A) על-ידי הזזת המעי הצידה. השתמשו במספריים קפיציים כדי לבצע חתך רוחבי קטן בווריד הנבוב התחתון כדי לאפשר שחרור של לחץ כלי הדם בכבד (איור 2Bi).
3. חשוף את צינור המרה המשותף ואת הווריד הפורטלי כמתואר בשלבים 1.2.4- 1.2.6.
4. הזיזו את המעי והלבלב לצד ימין (של הנסיין) באמצעות צמר גפן רטוב עם צמר גפן חוצץ פוספט (PBS).
5. הפוך את הצד הגחוני של הכבד לכיוון הלב באמצעות צמר גפן רטוב PBS כדי לחשוף את פני השטח הקרביים ואת האזור hilar.
6. אתרו את צינור המרה המשותף שעובר מאזור ההילאר דרך הלבלב אל תוך המעי בסוגר של אודי (איור 2Bii, צינור מרה משותף מסומן בקו צהוב מקווקו, ראשי חץ שחורים מצביעים על הסוגר של אודי).
   הערה: ודא שהכבד לח לאורך כל ההליך על ידי פיזור אותו עם PBS.
7. נקה את הרקמה שמסביב (שטח ~ 5 מ"מ) מצינור המרה המשותף באמצעות מלקחיים ישרים. הניחו חוט תפר משי (גודל 4-0, 0.17 מ"מ, אורך 3-5 ס"מ) מתחת לצינור המרה המשותף (איור 2Bii) וקשרו קשר רופף סביב צינור המרה המשותף (איור 2Biii).
   הערה: בחר אזור לקשר באמצע הדרך בין אזור ההילאר לסוגר של אודי ובמרחק מה מהווריד הפורטלי כך שלאחר הידוק התפר סביב צינור המרה המשותף, הוא לא יפריע להזרקת הווריד הפורטלי.
8. החזיקו את מספריים הקפיץ שטוחים כנגד צינור המרה המשותף כדי לבצע חתך אלכסוני לצינור המרה המשותף במקום בו צינור המרה המשותף נכנס ללבלב ולמעי ליד הסוגר של אודי. (איור 2Biv), קו צהוב מקווקו מתאר את הסוגר של אזור אודי, ומודגש על ידי ראשי חץ שחורים).
   הערה: זהו צעד מכריע. לעשות חתך אלכסוני ולא רוחבי, ולעשות חתך; אין לנתק את צינור המרה. חיתוך דרך צינור המרה כולו הופך את החדרת הצינורית למאתגרת מאוד.
9. ממש לפני השימוש, מערבבים 1 מ"ל של השרף הצהוב עם 50 מיקרוליטר של חומר הריפוי (על ידי מילוי וריקון מזרק 1 מ"ל) וממלאים מזרק Luer 1 מ"ל בתערובת חומר מרפא שרף.
10. חבר את המזרק המלא עם הצינור (להגדיר #1). לחץ על הבוכנה כדי למלא את הצינור לחלוטין. ודא שתערובת השרף/חומר הריפוי מטפטפת מקצה הצינור.
    הערה: הימנע והסר בועות במזרק ובצינורות לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
11. בעזרת מלקחיים, יישרו את האזור סביב חתך צינור המרה המשותף והכניסו את הצינורית לפתח בצינור המרה המשותף (איור 2Bv), כאשר הקצה הארוך ביותר של הקצה המשופע כלפי מטה לכיוון הצד הגבי של צינור המרה. כיוון זה מבטיח שהשרף יוכל לצאת מפתח הצינור, הפונה כלפי מעלה, לתוך הצינור (איור 2Bv).
12. הדקו את קשר חוט המשי כדי לאבטח את הצינורית בתוך צינור המרה המשותף (איור 2Bvi).
13. הזריקו את השרף לצינור המרה המשותף. שימו לב לכיס המרה ולאונות הכבד הבודדות.
14. עסו את הכבד עם צמר גפן רטוב PBS כדי לעזור לפזר את השרף באופן שווה. הענפים הסופיים של צינורות המרה מלאי השרף (בעכברי בר) נראים קלושים על פני הכבד.
    הערה: הזמן הצפוי למלא את הכבד הוא 30-100 שניות.
15. הפסיקו להזריק את השרף כאשר נקודות של שרף מופיעות על פני השטח של הכבד (איור 2Ci, ראשי חץ כחולים) או כאשר ההתנגדות מתקיימת.
    הערה: עבוד מהר ככל האפשר מאז השרף מתחיל להתקשות לאחר הוספת סוכן ריפוי שרף. זמן העבודה מהוספת סוכן הריפוי הוא כ -15 דקות.
16. הסר את הצינור על ידי משיכתו מתוך צינור המרה המשותף והידק במהירות את קשר המשי באמצעות מלקחיים כדי למנוע מהשרף לדלוף החוצה. חותכים את הקצוות הרופפים של תפר המשי, כך שהם לא יפריעו הזרקת ורידים פורטל.
17. יש להשליך את הצינור המכיל את השרף ואת שארית השרף לפסולת המסוכנת ואת המחט לפסולת החדה.

תוצאות

איור 1: סט הזרקות ליציקת שרף. (A) סט הזרקות #1 כולל מחט 30 G וצינור PE10 באורך ~30 ס"מ. סט הזרקה #2 מורכב ממחט 23 G וצינור PE50 ~ 30 ס"מ אורך. (B) קצה הצינור נמתח ונחתך בזווית ליצירת קצה משופע. הסרגל ב- A ו- B הוא סרגל סנטימטר, עם מרווחים גדולים של 1 ס"מ, דרגות ביניים של 5 מ"מ ומרווחים קלים של 1 מ"מ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.5 מ"ל צינורות מיקרו SafeSeal	זארשטדט	72.706
23 G מחט פרפר עם צינורות	BD bioscience	367283
23 גר' מחט	BD bioscience	305892
30 גר' מחט	BD bioscience	305106
אגרוז	טופ-ביו	P045
בנזיל אלכוהול	סיגמא אולדריץ'	108006
בנזיל בנזואט	סיגמא אולדריץ'	B6630
קורנינג 50 מ"ל צינורות	סיגמא אולדריץ'	CLS430829-500EA	פוליפרופילן
צמר גפן	מדיקרייר	60406
מיקרוסקופ דיסקציה	Leica מצלמה AG	לייקה M60
מלח חוצץ פוספט של Dulbecco	תרמופישר סיינטיפיק	14190144
אתנול 70%	VWR	83801.41
צינור בז 15 מ"ל	ורקון	331.850.084.006
מלקחיים מעוקלים	כלים מדעיים משובחים	11051-10	אפור דק 10 ס"מ מעוגל
מלקחיים ישר	כלים מדעיים משובחים	11050-10	אפור דק 10 ס"מ ישר
תמיסת פורמלדהיד	סיגמא אולדריץ'	F8775
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס	תרמופישר סיינטיפיק	14025092
הפארין	ליאו פארמה	B01AB01	5000 IE/מ"ל
איזולפוראן	בקסטר	FDG9623
מתנול	תרמופישר סיינטיפיק	11413413
מיקרופיל	פלוטק	MV-122	שרף סינתטי צהוב
מיקרופיל	פלוטק	MV-120	כחול שרף סינתטי
מיקרופיל	פלוטק	MV-דילול	מדלל שרף שקוף
פיפטה פסטר	ורקון	130.690.424.503
משאבה פריסטלטית	AgnThos	010.6131.M20
רוקר	VWR	444-0142
תפר משי	AgnThos	14757	משי שחור, 4-0, סטרילי, 100 m
מספריים לעור	כלים מדעיים משובחים	14058-09	איריס קצה ישר 9 ס"מ
מספריים קפיציים	כלים מדעיים משובחים	15000-03	Vannas מיקרו, קצה ישר 2 מ"מ
מזרק 1 מ"ל Luer	BD bioscience	303172
אבובים PE10	BD bioscience	427401
אבובים PE50	BD bioscience	427411