מערכת עירוי תרופות רציפה במודל עכבר: הליך כירורגי להשתלת מערכת עירוי משאבה מיקרו-אוסמוטית במוח העכבר לאספקת תרופות רציפה

תקציר

מקור: Ajoy, R., Chou, S. Y. חקר אות האינסולין ההיפותלמי לאי סבילות לגלוקוז היקפי עם מערכת עירוי תרופות מתמשכת למוח העכבר. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה אנו מדגימים הרכבה של מערכת עירוי מוח של משאבה מיקרו-אוסמוטית ואחריה השתלתה הכירורגית בגולגולת העכבר. מערכת זו מאפשרת אספקה רציפה של תרופות פוטנציאליות ומאפשרת לחקור את השפעתן על המוח ורקמת המוח.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת מערכות עירוי משאבות מיקרו-אוסמוטיות

הערה: הכינו את המשאבה, את חיץ הנוזל השדרתי המלאכותי (aCSF) ואת התרופה (Met-CCL5/RANTES protein solution (10 ng/mL in aCSF)) בתנאים סטריליים באמצעות חוצצים המסוננים במסנני 0.2 מיקרומטר ובצעו את כל ההליכים תחת מכסה המנוע של התרבית עם כפפות. הליכי הניתוח מתבצעים כדלקמן:

1. הכינו את המשאבות המיקרו-אוסמוטיות יום לפני הניתוח: מלאו את המשאבה המיקרו-אוסמוטית במוח בנוזל מוחי מלאכותי (aCSF) במזרק 1 מ"ל ומחט ראש קהה שסופקו יחד עם הערכה. טבלו את המשאבה המיקרו-אוסמוטית ב-aCSF והניחו אותה על שייקר ונערו בעדינות למשך הלילה.
   זהירות: יש למלא את המשאבה ב-aCSF ולהימנע מבועות אוויר בתוך המשאבה (איור 1A).
2. לפני תחילת הניתוח, הכינו את תמיסת החלבון הרקומביננטית Met-CCL5/RANTES (10 ננוגרם/מ"ל, מדוללת ב-aCSF) לשימוש בניסוי. הסר aCSF מהמשאבה ומלא את המשאבה בתמיסת התרופה באיטיות עד שהעודף דולף החוצה.
   הערה: פתרון aCSF של 15 מ"ל או Met-CCL5/RANTES מספיק עבור 5-8 משאבות.
   אזהרה: חזור על ההליך כדי לוודא שהמשאבה מלאה לחלוטין בתרופה ללא בועות בפנים.
3. חתכו את צינורות הצנתר לאורך הרצוי וחברו אותם עם מחט עירוי המוח הקהה בערכת עירוי המוח. מלא את ערכת עירוי צינורות עם התרופה.
4. לבסוף, הרכיבו וחברו את ערכת עירוי המוח למשאבה המיקרו-אוסמוטית.
   זהירות: אין ליצור בועות בצינור או במשאבה (איור 1A).
5. טבלו את כל האיחוי האוסמוטי של משאבה-מוח שנקבע ב-aCSF בצינור מעוקר של 50 מ"ל כדי למנוע מהמשאבה להתייבש. ערכת האיחוי האוסמוטית של משאבה-מוח מוכנה כעת לשימוש לניתוח.
   הערה: ניתן להשתמש במערכות המשאבה המיקרו-אוסמוטיות לעירוי תרופות לטווח ארוך. זה מבטיח מצב בטוח ונוח של העברת תרופות לתוך המוח העכבר.

2. כירורגיה חדרית תוך מוחית – השתלת משאבת מיקרו אוסמוטית

זהירות: יש לעקר את סביבת הניתוח עם 75% אתנול ולוודא שהאנשים המעורבים במחקר לובשים כפפות סטריליות וחלוק מעבדה נקי. כלי ניתוח / מכשירים חייבים להיות autoclaved ולייבש לפני השימוש, ולאחר מכן מעוקר עם 75% אתנול בין ניתוחי עכברים.

1. שקול את העכבר והרדים אותו באמצעות הזרקה תוך צפקית (IP) עם קטמין/קסילזין (קטמין 50 מ"ג/ק"ג, קסילזין 10 מ"ג/ק"ג).
   זהירות: עכברים שמשקלי גוף נמוכים מ-24 גרם אינם מומלצים לניתוח השתלת משאבה אוסמוטית.
2. הרכיבו וקיבעו את ראש העכבר על המנגנון הסטריאוטקטי (איור 1B).
3. השתמש בזוג מספריים כירורגיים וצבתות כדי לחתוך את העור החיצוני המכסה את הגולגולת. השתמש ביוד כדי לנקות את הגולגולת ההיקפית.
4. הפרידו את שכבת העור החיצונית ביותר מהעור התת-עורי בעזרת זוג צבתות ראש קהות ליד אזור הצוואר עבור השתלת ערכת איחוי משאבה-מוח אוסמוטית (איור 1C).
5. סמנו את נקודת העירוי תוך התייחסות למפת המוח (איור 1D) באמצעות המכשיר הסטריאוטקטי. בניסוי זה יש להשתיל את המחט באזור החדר השלישי (ברגמה: 0.0 מ"מ רוחבי, 1.3 מ"מ אחורי, 5.7 מ"מ גחוני).
6. קדחו חור באמצעות מקדח ציפורניים סביב האזור המסומן על הגולגולת (איור 1E).
   זהירות: היזהר לא לשבור את קרומי המוח וכלי הדם של העכבר, ובכך למנוע הפרעה של כלי דם זעירים במוח.
7. הניחו את ערכת האיחוי המיקרו-אוסמוטית של משאבה-מוח המכילה aCSF (כבקרה) או תרופה (תמיסת חלבון Met-CCL5/RANTES) מתחת לעור מאחורי אזור הצוואר והכניסו את מחט העירוי של המוח לתוך החור שנקדח כדי להחדיר את התרופה למוח העכבר (איור 1E). המחט תחדור את קרומי המוח ותיכנס לחדר. קבעו את המחט במקומה על הגולגולת באמצעות ג'ל להפחתת רגישות פני השטח (איור 1F) והמתינו 1-2 דקות עד שהדבק יתייבש. לאחר מכן, חתכו את החלק המקרין על גבי המחט (איור 1G-H).
8. השתמש בדבק דבק רקמות כדי לרפא את פצע הניתוח בראש. מרחו 50 מיקרוליטר של הדבק על גבי הפצע, משכו את שני צידי העור זה לזה והחזיקו מעמד במשך 30 שניות כדי לאפשר לעור לאטום (איור 1I).
   אזהרה: יש להשתמש בפד 100% אלכוהול לניקוי הפצע לאחר ניתוח וב-100 אול פניצילין עם סטרפטומיצין למניעת זיהום. הערה: עור העכבר ייצור רקמת צלקת ויחלים תוך מספר ימים לאחר מתן הדבק הניתוחי. היתרון העיקרי של הדבק הוא הימנעות מתפרים כירורגיים שעלולים לגרום לגירוי או דלקת בעור.
9. הניחו את העכבר בכלוב נקי שנשמר על צלחת חמה (מחוממת עד 37°C) והמתינו עד שהעכבר יתאושש מאפקט ההרדמה.
   זהירות: חיוני לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר כדי לשפר את סיכויי ההישרדות לאחר הניתוח.
10. לאחר תקופת החלמה של שבוע, העכברים יהיו מוכנים לניסויים נוספים, כגון בדיקת סבילות לגלוקוז דרך הפה (OGTT) ובדיקת סבילות לאינסולין (ITT).

תוצאות

איור 1. הכנת משאבה אוסמוטית והשתלה כירורגית בעכבר. (A) ערכת עירוי המוח והכנת המשאבה מחוררים בתמיסת סמים. חיצים אדומים מציינים את צינורות הצנתר המלאים בנוזל. (B) תקן והרכיב את ראש העכבר על המנגנון הסטריאוטקטי. (ג) להפריד את השכבה החיצונית ביותר של העור מהעור התת-עורי לצורך השתלת ערכת עירוי מיקרו-אוסמוטית של משאבה-מוח; קווי מקף מציינים את מיקומם של שתלי משאבה אוסמוטית....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דבק רקמות Vetbond	3 דקות	#1049SB	הדבק המשמש לאיטום אתר הנגע על ראש העכבר
דבק מיידי LOCTITE 454	תאגיד Durect	#8670	הדבק המשמש לקיבוע המחט על גולגולת העכבר
משאבה מיקרו-אוסמוטית Alzet	תאגיד Durect	#9922	0.11 מיקרוליטר לשעה, 28 ימים
מערכת עירוי המוח	תאגיד Durect	#8851	1-3 מ"מ, משמש כדי לבלבל את התרופה לתוך המוח עכברים
יחידת בקרה MIO NE116 (מקדחה ציפורניים)	מערכת מיו	#E235-015	כדי לקדוח חור בגולגולת העכבר
נוסחת aCSF	119 מ"מ NaCl 26.2 מ"מ NaHCO3 2.5 מ"מ KCl 1 מ"מ NaH2PO4 1.3 מ"מ מ"ג Cl2 10 מ"מ גלוקוז		יש לעקר את המסנן באמצעות מנגנון סינון של 0.22 מיקרומטר, ולאחסן בטמפרטורה של 4°C. aCSF יציב למשך 3-4 שבועות