הדמיה תוך-חיונית: שיטה לתצפית ברמה התאית על לבלב העכבר דרך חלון הדמיה מיוצב

Abstract

מקור: Park, I. and Kim, P. Stabilized Longitudinal in Vivo Cellular-Level Visualization of the pancreas in a Murine Model with a pancreatic intravital imaging window. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה, אנו מתארים הדמיה תוך-חיונית של לבלב עכבר דרך חלון מיוצב להדמיה ארוכת טווח של דינמיקה תאית.

Protocol

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הדמיה תוך חיונית

1. הפעל את המיקרוסקופ התוך חיוני כולל כוח הלייזר.
2. הפעל את כרית החימום והגדר את הוויסות ההומאותרמי ל- 37 ° C.
   הערה: לחלופין, השתמש בכרית חימום פסיבית או במנורה עם שליטה תכופה אם אין ויסות הומיאותרמי.
3. קח עכבר עם חלון לבלב מושתל מראש. בצע הרדמה תוך שרירית עם תערובת של tiletamine/zolazepam (30 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג).
   הערה: שימוש בטילטמין/זולאזפם מומלץ במקום קטמין בגלל ההשפעה השלילית של היפרגליקמיה. יש לבחור הרדמה אופטימלית לצורך הניסויים.
4. הכנס קטטר כלי דם להזרקה.
   1. הפעל לחץ על הצד הפרוקסימלי של הזנב עם האצבע המורה והאצבע השלישית כחלופה ליישום חוסם עורקים. מחממים את הזנב עם מנורה במידת הצורך.
   2. לעקר את וריד הזנב עם תרסיס אתנול 70%.
   3. הכנס קטטר 30 גרם לווריד הזנב הצידי. Regurgitation של הדם יהיה דמיינו בצינור PE10.
   4. יש למרוח סרט משי על הצנתר כדי לייצב אותו.
   5. הזריקו FITC/TMR דקסטרן או בדיקות פלואורסצנטיות אחרות (25 מיקרוגרם של אנטי-CD31 מצומד עם Alexa 647), לפי הצורך, בהתאם לשילוב של בדיקות פלואורסצנטיות.
      הערה: עבור בדיקות נוגדנים מצומדות פלואורסצנטיות, יש להזריק שעתיים לפני פגישת ההדמיה.
5. העבר את העכבר מהפלטפורמה הכירורגית לשלב ההדמיה.
6. הכנס בדיקה רקטלית כדי לשלוט באופן אוטומטי בטמפרטורת הגוף באמצעות מערכת כרית החימום ההומאורמית.
7. הכניסו את חלון ההדמיה של הלבלב למחזיק החלון שהוכן במהלך מערך המיקרוסקופ התוך-חיוני (איור 1). עבור מיקרוסקופ הפוך, ייתכן שלא יהיה צורך במחזיק חלון.
8. בצע הדמיה תוך חיונית.
   1. להדמיית הלבלב, התחל עם עדשה אובייקטיבית בהגדלה נמוכה (למשל, 4x) לסריקת כל התצוגה של הלבלב בחלון ההדמיה של הלבלב (שדה ראייה מומלץ: 2500 x 2500 מיקרומטר).
   2. לאחר קביעת אזור העניין, עבור לעדשה אובייקטיבית בהגדלה גבוהה יותר (20x או 40x) כדי לבצע הדמיה ברמה התאית (שדה ראייה מומלץ: 500 x 500 מיקרומטר או 250 x 250 מיקרומטר). בניסוי זה, הרזולוציה הצידית והצירית הייתה בערך 0.5 מיקרומטר ו-3 מיקרומטר, בהתאמה.
   3. בצע הדמיה של מחסנית z או קיטועי זמן כדי לבחון את המבנה התלת-ממדי או את הדינמיקה ברמת התא, כגון העברת תאים.
      הערה: לצורך הדמיה של חלבון פלואורסצנטי המבטא תאים של בעלי חיים טרנסגניים (MIP-GFP), 30 שניות של חשיפה לסירוגין ללייזר של 488 ננומטר בעוצמה של עד 0.43 mW היו נסבלות ללא הלבנה מורגשת או נזק לרקמות. לצורך הדמיה של החלבונים הפלואורסצנטיים המסומנים ב-Alexa 647, עוצמת הלייזר של 640 ננומטר עד 0.17 mW הייתה נסבלת ללא הלבנה מורגשת או נזק לרקמות. חשיפה ממושכת ללייזר עירור עם עוצמה מעל הגדרה זו עלולה להוביל להלבנה או נזק לרקמות על ידי פוטוטוקסיות. התאם את הרווח והכוח המתאימים כדי לדמיין כראוי את אזור העניין. קביעה מפורטת של פרמטרים במיקרוסקופ תוך-חיוני חייבת להיות מותאמת אישית לכל מיקרוסקופ תוך-חיוני המוכן במכון.

Results

איור 1: צילום של יישום חלון ההדמיה התוך-חיונית של הלבלב.חלון הדמיה תוך-חיוני של הלבלב מושתל בעכבר בשלב התרגום XYZ ומחזיק תא ההדמיה המחובר לתושבת ההטיה מחובר לחלון ההדמיה של הלבלב. זכויות יוצרים 2020 האגודה הקוריאנית לסוכרת מ סוכרת Metab J. 2020 44: 1: 193-198. הודפס מחדש באישור האגודה הקוריאנית לסוכרת.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 אסטרים Succinimidyl (אסטרים NHS)	Invitrogen	A20006	בדיקה פלואורסצנטית להצמדה עם נוגדן
צינורות פוליאתילן אינטרמדיק BD	BD Biosciences	427401	צנתר PE10 לחיבור עם מחט
C57BL/6N	אוריינטביו	C57BL/6N	C57BL/6N
כיסוי משקפיים עגול	מרינפלד	0111520	זכוכית כיסוי לחלון הדמיה של הלבלב
FITC דקסטרן 2MDa	מרק (לשעבר סיגמא אולדריץ')	FD200S	לזיהוי כלי שיט
אימריס 8.1	ביטפליין	אימריס	עיבוד תמונה
מיקרוסקופ תוך חיוני	טכנולוגיית IVIM	IVM-C	מיקרוסקופ תוך חיוני
MIP-GFP	מעבדת ג'קסון	006864	ב6. Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
חלון הדמיה של הלבלב	הנדסת גאומטו	הזמנה מותאמת אישית	חלון הדמיית לבלב - הזמנה מותאמת אישית
פיזיוסוויט	קנט סיינטיפיק	PS-02	בקר טמפרטורה הומאותרמי
TMR דקסטרן 65-85kDa	מרק (לשעבר סיגמא אולדריץ')	T1162	לזיהוי כלי שיט
מחזיק חלונות	הנדסת גאומטו	הזמנה מותאמת אישית	מחזיק חלונות - הזמנה בהתאמה אישית
זולטיל	וירבאק	זולטיל 100	חומר הרדמה
רומפון	באייר	רומפון	חומר הרדמה