קיבוע לחץ של מסתם ריאתי מורין מבודד: הליך לבידוד ותיקון כימי של המסתם הריאתי של העכבר בקונפורמציה סגורה

תקציר

מקור: Liu, Y., et al. Surgery and Sample Processing for Correlation Imaging of the Murine Pulmonary Valve. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה, אנו מתארים את ההליך לבידוד וקיבוע כימי של ערך הריאתי של העכבר בקונפורמציה סגורה באמצעות לחץ זילוח.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. כריתת מסתם ריאתי

1. Autoclave את הכלים הדרושים עבור דיסקציה העכבר. זה כולל מספריים עדינים, מיקרו מלקחיים, מלחציים מיקרו וסקולריים, מהדק יישום מלקחיים, מחזיקי מיקרו-מחט, מספריים קפיציים, ו retractors.
2. התאקלמו אצל כל העכברים לפחות שבועיים לפני הניתוח. הוציאו עכברי C57BL/6, בני שנה בערך, מהכלובים שלהם ושקלו, ואז הרדימו עם קוקטייל קטמין/קסילזין (3:1 קטמין:קסילזין, 0.01 מ"ל לגרם) מנת יתר.
3. הניחו את העכבר במצב שכיבה גבי על מגש והדקו את גפיו בנייר דבק. לאחר האבטחה, לבצע את thoracotomy.
   1. חשוף את הלב על ידי הסרת רקמת שומן עודפת ו fascia.
   2. יש להסיר את האטריום הימני ולנקב דרך החדר השמאלי בעזרת תמיסת מלח בטמפרטורת החדר (0.9% NaCl). הזלוף צריך לקחת בערך 20 מ"ל מעל 30 שניות. התוצאה היא הוצאה של העכבר.
4. הסר את הלב כולו על ידי ניתוק הווריד הנבוב העליון, הווריד הנבוב התחתון, עורק הריאה ואבי העורקים. יש להקפיד במיוחד על עורק הריאה. חותכים כ -2 מ"מ מעל צומת חדרי-עורקי, שכן זה ישמש צינור ללחץ.
5. הסר את החדר השמאלי והימני כדי לחשוף את החדרים ללחץ אטמוספרי. ודא כי המבנה של תא המטען הריאתי צריך להיות מושפע על ידי הסרת החדרים.

2. קיבוע לחץ של שסתום ריאתי

1. צינורות לחץ אנסטומוז עם עורק ריאתי, משאיר מרחק של כ -1 מ"מ בין הצומת הסינו-צינורית לקצה הצינור כדי להתאים לתנועות גדולות של העלונים וגזע הריאה.
2. העלו את המאגר ללחץ פיזיולוגי מקביל ומלאו אותו בתמיסת מלח. בדוק את מערכת הזרימה כדי לוודא שאין סתימות או בועות אוויר.
3. חבר סטופקוק לשסתום הריאתי האנסטומוזי וודא זרימה נאותה דרך הצינור (כלומר, ללא בועות אוויר) על ידי החלפת מערכת היציאה. ברגע שהזרימה מספקת, העבר את הזרימה החוצה למסתם הריאתי האנסטומוזי וודא לחץ לחץ של גזע הריאות. זה מזוהה על ידי התנפחות תא המטען הריאתי.
4. לאחר אישור הלחץ של תא המטען הריאתי, לשלב בהדרגה פתרון קיבוע ראשוני (1.25% גלוטראלדהיד, 1.0% paraformaldehyde ב 0.15 M cacodylate) עד תמיסת מלוחים הוא טיהור. הדבר נעשה על ידי הסרת חלק, כ-25% מקיבולת המאגר, של תמיסת המלח והחלפתה בקיבוע הראשי.
   זהירות: חומרי הקיבוע המשמשים (פרפורמלדהיד וגלוטראלדהיד) רעילים מאוד ויש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE) כדי להבטיח בטיחות.
5. הניחו גזה ספוגה בקיבוע על דגימת הרקמה כדי למנוע התייבשות.
6. מנקבים את הקיבוע למשך 3 שעות, וממלאים מחדש את המאגר לפי הצורך כדי לשמור על לחץ קבוע. במהלך הקיבוע, אין זה נדיר עבור שסתום הריאה להתכווץ בגלל הקיבוע הכימי. אם זה המקרה, כל הזמן לחדש את המאגר עם קיבוע ראשוני כדי לשמור על לחץ פיזיולוגי.
7. יש לאחסן את שסתום הלב בתמיסת הקיבוע בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. הדגימות אוחסנו עד שבוע ללא הבדל ניכר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
25% גלוטראלדהיד (AQ)	EMS	16210	רכיב קיבוע עיקרי
0.9% הזרקת נתרן כלורי	הוספירה בע"מ	NDC 0409-4888-10
1 מזרק מ"ל	ב.ד.	309659
מזרק 10 מ"ל	ב.ד.	309604
מחט 22 גרם	ב.ד.	305156
סטופרקוק תלת-כיווני	סמיתס מדיקל ASD, Inc	MX5311L
4% פרפורמאלדהיד (AQ)	EMS	157-4-100	רכיב קיבוע עיקרי
C57BL/6 עכברים	מעבדות ג'קסון	664	בערך 1 יו
מהדק הפעלת מלקחיים	FST	00072-14
Dumont #5 מלקחיים	FST	11251-20
Dumont #5/45 מלקחיים	FST	11251-35
Dumont #7 מלקחיים עדינים	FST	11274-20
מספריים עדינים	FST	14028-10
תמיסת מלח (סטרילית 0.9% נתרן כלורי)	הוספירה בע"מ	NDC 0409-0138-22
מיקרוסקופ כירורגי	לייקה	M80
מחזיק מחט טיש / מלקחיים	מיקרינים	MI1540
גוזם	וואהל	9854-500
תפר מונופילמנט פוליאמיד שחור, 10-0	תאגיד מכשירים כירורגיים	TI38402
תפר מונופילמנט פוליאמיד שחור, 6-0	תאגיד מכשירים כירורגיים	SN-1956
הזרקת קטמין הידרוכלוריד	הוספירה בע"מ	NDC 0409-2053
חומצה L-אספרטית	סיגמא-אולדריץ'	56-84-8	רכיב צביעה
עופרת חנקתית	EMS	17900	רכיב צביעה
נתרן קקודילט טריהידראט	סיגמא-אולדריץ'	6131-99-3	מאגר
שירים לא ארוגים	חברת McKesson	94442000
מיקרו-אדסון מלקחיים	FST	11018-12
מסנן Millex-GP, 0.22 אום, PES 33 מ"מ, לא סטרילי	EMD Millipore	SLGP033NS