מודל Mouse Ileal Loop: מודל כירורגי לחקר חדירות המעי בעכבר

תקציר

מקור: Boerner, K., et al. Functional Assessment of Inpetinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in עכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את יצירתו של מודל לולאה איליאלית לחקר חדירות המעי במודל עכבר. שיטה זו מספקת מודל חי להבנת תפקוד מחסום האפיתל והתגובה החיסונית הנובעת ממנו.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. יצירת הלולאה האיליאלית

1. הכנת העור: לשפשף פרווה של קו האמצע של הבטן עם מקלוני אלכוהול או ספוג גזה ספוג עם אתנול 70%. אין להרטיב שטח רחב של פרווה עם אלכוהול כדי למנוע היפותרמיה.
2. באמצעות מספריים, לבצע laparotomy קו האמצע. בצע חתך אנכי באמצע הבטן (כ 2 ס"מ אורך) ולחשוף את הצפק. היזהר לא לפגוע באיברים תוך בטניים.
3. מניחים גזה כותנה רטובה חתוכה מראש על החלל התוך בטני החשוף.
4. השתמשו במקלוני צמר גפן רטובים כדי לנייד ולהוציא החוצה את הצאקום. בזהירות מניחים את caecum על גזה כותנה רטובה.
   הערה: Caecum ממוקם ברביע הקאודלי השמאלי של חלל הבטן ברוב העכברים ללא תלות במין החיה.
5. השתמשו במקלוני צמר גפן רטובים כדי לנייד ולהוציא בעדינות החוצה את האילאום שהחלק הטרמינלי שלו (הקצה הדיסטלי) מחובר לצאקום (איור 1B).
6. לפרוס לפחות 6 ס"מ של ileum מסוף על גזה כותנה רטובה ללא הפרעה של כלי mesenteric ואת אספקת הדם. אספקת הדם נשמרת אם אין דימום, והרקמה שומרת על צבעה הוורוד (איור 1B).
   הערה: הימנע מייבוש של רקמות חשופות על ידי שמירה על לחות רקמות כל הזמן עם HBSS חם (כל 2 - 3 דקות) באמצעות מזרק 10 מ"ל מחובר מראש לצינור הזנה צהוב.
7. קרוב לצאקום, לזהות את העורק הראשי במזנטריה, אספקת דם לאילאום. לאחר מכן אתרו שני אתרי קשירה במזנטריה שאינם מכילים כלי דם קריטיים.
8. באמצעות מלקחיים רקמתיים קהה, לתפוס בחוזקה את ileum מסוף (הקרוב ביותר caecum) ובאמצעות מלקחיים קצה עדין, fenestrate mesentery הימנעות כלי דם. מניחים את תפר המשי לרוחב הנקב וקושרים קשר כירורגי ליצירת הקשירה הראשונה (קצה דיסטלי של הלולאה).
9. השתמשו בסרגל כדי למדוד 4 ס"מ מהליגטורה הראשונה וליצור את הליגטורה השנייה (הקצה הפרוקסימלי של הלולאה) כפי שמוזכר בשלב 2.8 (איור 1C).
10. בעזרת מספריים עדינים חתוכים בזהירות ליד כל קשירה כדי לבודד את הלולאה האילית בקוטר 4 ס"מ, תוך שמירה על אספקת דם שלמה וקרום מזנטרי.
    הערה: חתכו את שני הקצוות של המקטע החיצוני של ה-iLoop, ולאחר מכן שטפו בעדינות כצעד הכרחי המונע הפרעה לתוכן הלומינלי (חומר צואתי), ובכך מאפשר אפילו פיזור של גירויים FITC-דקסטרן או כימוטקטיים לכל אורכו של המקטע המבודד, כמו גם מאפשר כימות מדויק יותר של לויקוציטים על ידי ציטומטריית זרימה. הליך זה מאפשר גם התנפחות אחידה של הרירית לאחר הזרקת נפחים מוגדרים של מגיב ויכולת שחזור טובה יותר בין בעלי חיים.
11. שטפו בעדינות את תכולת מקטע הלולאה האיליאלית עם HBSS חם באמצעות צינור הזנה צהוב גמיש המחובר למזרק 10 מ"ל.
12. קשרו את שני הקצוות החתוכים של הלולאה האיליאלית הסמוקה באמצעות תפר משי.
13. השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 30 G כדי להזריק לאט 250 μL של מגיב כגון FITC-dextran או chemokine לתוך לומן המעי. הלולאה האיליאלית תתנפח ותגרום להתנפחות מתונה של הרירית (איור 1D).
    הערה: הזריקו מגיב לתוך לומן לולאה בצד הנגדי של העורק mesenteric. יש להיזהר שלא לשלוף את הלולאה האיליאלית מהחיה בזמן ההזרקה כדי למנוע קריעת כלי דם וגרימת דימום.
14. בעזרת מקלוני צמר גפן רטובים, מחזירים בעדינות את הלולאה האיליאלית, האילאום הפרוקסימלי והצאקום.
15. השתמש במחזיק מחט, מלקחיים אנטומיים ותפרי משי 3.0 שאינם נספגים עם מחט חיתוך לאחור כדי לסגור את דופן הבטן.
16. הניחו את בעל החיים בתא הרדמה מווסת טמפרטורה למשך תקופת הדגירה.

תוצאות

איור 1: מודל הלולאה האיליאלית. (A) סקירה סכמטית של מודל הלולאה האיליאלית. הלפרוטומיה החציונית מבוצעת בעכברים תחת הרדמה ומונחת על לוח ניתוחים מבוקר טמפרטורה. (B) יציאה של הקקום (*), האילאום והמזנטריה. מזוהים שני אתרים מתאימים לקשירה (1,2). (C) בודד קטע באורך 4 ס"מ: הליגטורה הראשונה (1) ממוקמת קרוב לצומת האילאו-צקאלי, והליגטורה השנייה (2) ממוקמת במרחק של 4 ס"מ מהליגטורה הראשונה. (D) שני חתכים קטנים נעש...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ציוד וחומרים
מקלוני אלכוהול BD	ב.ד.	326895
מחט BD PrecisionGlide, 25G x 5/8"	ב.ד.	305122
מחט BD PrecisionGlide, 30G x 1/2"	ב.ד.	305106
מזרק שחפת BD 1 מ"ל ללא מחט	ב.ד.	309659
15 מ"ל צינור צנטריפוגה	קורנינג	14-959-53א
קורנינג 96-באר מוצק שחור פוליסטירן microplate	פישר סיינטיפיק	07-200-592
מנת תרבית לא מטופלת קורנינג, 10 ס"מ	MilliporeSigma	CLS430588
מוליך צמר גפן (צמר גפן), 6 אינץ', סטרילי	פישר סיינטיפיק	25806 2WC
ספוגי גזה במילוי כותנה Dynarex, לא סטריליים, 100X20 ס"מ	מדקס	3249-1
וופורייזר הרדמה EZ-7000 (מערכת קלאסית, כולל יחידות חימום)	מערכות E-Z	EZ-7000
מספריים עדינים של מוריה	FST	14370-22
משחה וטרינרית Puralube, חומר סיכה סטרילי לעין	Dechra	12920060
מלקחיים טבעתיים (מלקחיים רקמתיים קהים)	FST	11103-09
Roboz Surgical 4-0 משי שחור קלוע, 100 YD	פישר סיינטיפיק	NC9452680
מלקחיים Semken (מלקחיים אנטומיים)	FST	1108-13
Sofsilk לא נספג מצופה שחור תפר משי קלוע גודל 3-0, 18 אינץ', מחט 19 מ"מ אורך 3/8 עיגול חיתוך הפוך	הנרישיין	SS694
מלקחיים עדינים לסטודנטים, זוויתיים	FST	91110-10
מזרק 10 מ"ל PP/PE ללא מחט	מיליפור סיגמא	Z248029
צינורות הזנה צהובים למכרסמים 20G x 30 מ"מ	אינסטק	FTP-20-30
פתרונות ומאגרים
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס	קורנינג	21-023-CV
מלח חוצץ פוספט ללא סידן ומגנזיום	קורנינג	21-040-CV
איזופלורן	הלוקרבון	12164-002-25