בידוד מיופייבר: טכניקה להשגת מיופייבר יחיד משריר Extensor Digitorum Longus (EDL) של עכבר שנקצר

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בידוד שרירי EDL ועיכול collagenase

1. רססו את כל הציוד באתנול 70% כדי למנוע זיהום.
2. להקריב את העכבר בהתאם לתקנות הלאומיות לניסויים בבעלי חיים.
3. רסס את הגפיים האחוריות של העכבר עם 70% אתנול. השתמש במספריים מעוקלים עדינים קשוחים (קצה חיתוך 24 מ"מ) ומלקחיים עדינים (Dumont 7, מעוקל או ישר) כדי להסיר את העור ולחשוף את השרירים שמתחתיו. הימנע מכל מגע של השרירים הבסיסיים עם פרווה (מגביר את הסיכון של זיהום).
4. הסירו את הפאשיה שמסביב בעזרת מלקחיים עדינים ומעוקלים מבלי לפגוע בשרירים שמתחתיה (איור 1A). סגור את המלקחיים כדי למנוע כיפוף.
5. השתמש במלקחיים מעוקלות כדי לחשוף את הגידים הדיסטליים של שריר TA (tibialis anterior) ושריר EDL. כדי להסיר את ה-TA, יש לתפוס את גיד ה-TA הדיסטלי במלקחיים ולחתוך בעזרת מספריים קפיציים עדינים של Vannas (קצה חיתוך 5 מ"מ, קוטר קצה 0.35 מ"מ). בעת החזקת ה-TA בגיד, משכו אותו לכיוון הברך וחתכו את השריר קרוב לברך (איור 1B), שריר ה-EDL נחשף כעת.
   הערה: יש לוודא שרק גיד TA נתפס בשלב זה, אחרת ה-EDL הבסיסי עלול להיפגע. בעת כריתת שריר ת"א יש לוודא כי הגידים בברך נראים בקלות לאחר מכן.
6. הרימו את גיד ה-EDL הדיסטלי בעזרת מלקחיים מעוקלים עדינים וחתכו בעזרת מספריים קפיציים עדינים של Vannas (איור 1C). חשוף את גיד ה- EDL הפרוקסימלי על ידי משיכה זהירה של ה- EDL לכיוון הברך. חותכים את הגיד הפרוקסימלי במספריים קפיציים עדינים של Vannas. מעבירים את שריר ה-EDL ל-37°C שחומם מראש ב-2.5 מ"ל של תמיסת עיכול collagenase, בצינור התגובה של 15 מ"ל. פתרון collagenase מוכן על פי הליך זה:
   1. הכינו תמיסת עיכול של collagenase על ידי המסת 0.2% (w/v) collagenase type 1 (מ-Clostridium histolyticum) ב-DMEM (מדיום הנשר המעובד של Dulbecco עם גלוקוז 4.5 גרם/ליטר ונתרן פירובט), סננו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. (איור 1D).
      הערה: בצע חתך קטן ברקמת החיבור החיצונית של הברך כדי לחשוף באופן מלא את גיד ה- EDL הפרוקסימלי. הקפידו לתפוס רק את הגידים ולא למתוח את ה-EDL יותר מדי.
7. חזור על שלבים 1.3 עד 1.6 עם ה- EDL השני. הוסף את שני שרירי ה- EDL לאותו צינור תגובה של 15 מ"ל המלא בתמיסת עיכול קולגנאז 2.5 מ"ל.
8. יש לדגור על שרירי ה-EDL בצינור התגובה בטמפרטורה של 37°C באמבט מים במחזור.
   הערה: זמן הדגירה תלוי במספר גורמים, כגון פעילות קולגן, גיל העכבר וכמות הרקמה הפיברוטית . זמן הדגירה האופייני לשרירי EDL של עכברים בוגרים (גיל 2-6 חודשים) הוא 1-1.5 שעות ולעכברים מבוגרים (גיל 18 חודשים) 1.5-2 שעות.
9. כדי למנוע עיכול מוגזם של השרירים, לבדוק את השרירים במהלך זמן העיכול. עצרו את העיכול כאשר השרירים משתחררים ונראים שרירי שריר בודדים (איור 1E). העבירו את השרירים בזהירות עם פיפטה גדולה לבאר הראשונה של צלחת 12 בארות שחוממה מראש ומכילה מדיום בידוד מיופייבר (איור 1G), אשר מוכנה באופן הבא:
   1. תוסף DMEM (מדיום הנשר המותאם של Dulbecco עם 4.5 גרם / ליטר גלוקוז ונתרן פירובט) עם 20% FBS (סרום בקר עוברי), סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. הוסיפו בינוני ללוחות הבידוד המצופים מראש (צלחת 12 בארות, 2-4 מ"ל מדיום בידוד לבאר) כ-30 דקות לפני הבידוד ושיווי משקל באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.

2. דיסוציאציה של מיופייבר

1. עבור השלבים הבאים להשתמש מיקרוסקופ דו-עיני סטריאו, רצוי מצויד צלחת חימום (37 ° C). השתמשו בפיפטת הבור הגדולה כדי לשטוף את השרירים במדיום בידוד חם עד לשחרור שרירי שריר בודדים. נתקו את השרירים עם פיפטה גדולה משעמם עד המספר הרצוי של myofibers צפים בחופשיות בתמיסה.
   הערה: הימנע trituration מוגזם כדי להפחית את הסיכון של myofibers פגום. מומלץ מאוד להשתמש בפלטת חימום לדיסוציאציה של מיופייבר מכיוון שהטמפרטורה יורדת במהלך תהליך הבידוד, מה שיגרום למוות של מיופייבר.

איור 1. דיסקציה EDL של עכבר ובידוד מיופייבר יחיד.(A) העור של הגפה האחורית של העכבר מוסר והשריר שמסביב לפאסיה נמשך הצידה כדי לחשוף את שריר TA (טיביאליס קדמי). (B) שריר TA מוסר כדי לחשוף את שריר ה-EDL (extensor digitorum longus), המסומן על ידי החץ הלבן. (C) שריר ה-EDL מנותח על ידי חיתוך הגידים שלו. (D) שני שרירי EDL מתעכלים באמצעות קולגן. (E) מראה של שריר מעוכל של collagenase עם מיוסיבים בודדים נראים לעין משתחררים מליבת הרקמה. (F) פיפטה פסטר גדולה וקטנה עם קנה מידה. (G) שרירי ה-EDL (המסומנים בחצים שחורים) עוברים טריטוציה פיזית באמצעות פיפטה גדולה של פסטר. (H) שרירי מיופייבר שלמים בודדים הם דקים ומבריקים וניתן לאסוף אותם בנפרד לצורך תרבית וניתוח. (I) מיופייבר היפר-קבלני ומת אינם מתאימים לתרבית ולניתוח. התמונות המיקרוסקופיות של 2H ו-2I צולמו במיקרוסקופ באמצעות מטרה N-Achroplan 5x. מוטות קנה מידה הם 200 מיקרומטר.