מודל עכבר אנדופתלמיטיס חיידקי: שיטה ליצירת אנדופתלמיטיס חיידקית באמצעות הזרקה תוך ויטריאלית של תרחיף חיידקי לעין העכבר

תקציר

מקור: Mursalin, M. H. et al., הזרקה תוך ויטריאלית וכימות של פרמטרים של זיהום במודל עכבר של אנדופטלמיטיס חיידקי. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מתאר שיטה ליצירת מודל עכברי המחקה אנדופתלמיטיס חיידקית – זיהום תוך עיני הנובע מפלישה חיידקית לחלל הזגוגית של העין – באמצעות הזרקה תוך ויטריאלית של תרחיף חיידקי לעין. מודל עכבר זה מסייע ללמוד את מנגנון המחלה ולהעריך טיפולים עבורה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. מחטי זכוכית סטריליות

1. הפעל את מושך פיפטת המחט.
2. כוונן את ידית החימום עד שהתצוגה תראה 12.6.
3. פתחו את הדלת והזינו ידנית את צינור הנימים 5 μL דרך המהדק העליון וחוט החימום עד שמחצית הצינור נמשך מתחת לחוט הלהט (איור 1A).
4. אשר כי צינור נימי הוא בחריץ "V" במהדק העליון. הדקו את המהדק העליון.
5. כאשר המהדק התחתון פתוח, כוונן ידנית את ההחלקה האנכית כלפי מעלה עד שהמהדק התחתון יגיע לגבול העליון שלו. אשר כי הצינור נמצא בחריץ "V" במהדק התחתון. הדקו את המהדק התחתון.
6. סגרו את הדלת ואשרו שנורת ה'מוכן' דולקת. לחצו על כפתור Start כדי להפעיל את תנור החימום ואת רצף המשיכה (איור 1B).
7. ודאו שתנור החימום נכבה אוטומטית לאחר שהחום וכוח הכבידה מפרידים את צינור הנימים (איור 1C), ושהמגלשה נעה כלפי מטה.
8. פתח את הדלת. תוך כדי החזקת החלק העליון של צינור הנימים, לפתוח את המהדק העליון. הסר את צינור הנימים העליון והניחו אותו בצד.
9. החזק את צינור הנימים במגלשה התחתונה ושחרר את המהדק התחתון. הסר את צינור הנימים התחתון והניחו אותו בצד.
10. השתמש בשיפוע מיקרואלקטרודות עם צלחת שחיקה אלומינה 0.05 מיקרומטר כדי לשקע את צינור הנימים המשוך כדי ליצור את מחטי ההזרקה.
11. פיפטה מספיק מים על צלחת הטחינה כדי לכסות את פני השטח (איור 1D).
12. הפעל את המשופע כך שיתחיל להסתובב ב -60 סל"ד. מניחים את צינור נימי משוך לתוך מהדק פיפטה בחריץ "V". הדקו את המהדק וכווננו את זווית מהדק פיפטה ל-30°.
13. התאימו את קצה הקצה המחודד של צינור הנימים במרחק של כשני שלישים ממרכז הסיבוב של צלחת השחזה.
14. הורד את צינור הנימים המהודק על ידי התאמת ידית הבקרה הגסה בחלק העליון של המניפולטור. ממשיכים להוריד את צינור הנימים עד שקצה צינור הנימים משתרע מתחת לפני המים ובא במגע עם פני השטח השוחקים של צלחת השחזה.
15. עקוב אחר התקדמות השיקוע באמצעות המיקרוסקופ המחובר לבבלר. לאחר 5 דקות, כוונן את הבקרה העדינה כדי להרים את מחט הזכוכית מצלחת השחזה.
16. הסירו את מחט הזכוכית והניחו אותה תחת הגדלה של פי 10 כדי לבדוק את קצה צינור הנימים (איור 1E,F).
17. כדי לוודא שאין חסימות, הכנס את מחט הזכוכית למחזיק פיפטה על מזרק ודחוף אוויר לתוך צינור 1 מ"ל של 99% אתנול. אם נוצרות בועות אוויר בקצה המחט, למחט אין חסימות וניתן להשתמש בה למיקרו-הזרקה. תהליך זה גם מבטיח את הסטריליות של מחטי הזכוכית.
18. צינור נימי אחד יכול להכיל עד 5 μL נוזל. סמן את צינור הנימים ל -10 חלקים כדי לחשב את המרחקים על המחט כדי לסמן עבור נפחים של 0.5 μL. סמן סולם עם מרחק זה המכיל 0.5 μL להכנה עתידית. עבור מחט של 5 μL, מרחקים של 0.7 מ"מ זה מזה שווים ל-0.5 μL (איור 1G).

2. הזרקה תוך ויטריאלית של עכבר

1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה בתנאי בטיחות ביולוגית רמה 2.
2. הכן את אתר ההליך על ידי הנחת תחתיונים רפואיים על שולחן הניתוחים.
3. הפעל את המיקרו-מזרק ופתח את שסתום הגז במיכל האוויר הדחוס המחובר למיקרו-מזרק. התאם את וסת המיכל עד שאספקת הגז תהיה כ- 60 psi.
4. במיקרו-מזרק, לחץ על מצב עד שהמסך יציג איזון. לחץ על איזון והנח את עכבר המחשב על שולחן הניתוחים. חבר את מחזיק הפיפט מנירוסטה לצינור המחובר ל'מילוי/פלט' של המזרק. צינור זה מחובר תמיד למזרק.
5. הכנס את מחט הנימים לקצה השני של מחזיק הפיפט על ידי הברגת מחבר מחזיק הפיפט סביב המחט.
6. הפעל את המיקרוסקופ האופטלמי והדליק את אורו לעוצמה של 50%. כוונן את המיקרוסקופ מעל אתר הפרוצדורה על שולחן הניתוחים והתאים את המיקרוסקופ למיקוד הרצוי.
7. לפני תחילת ההליך, ודא כי העכבר מורדם כראוי על ידי בדיקת רפלקס נסיגה הדוושה. הקפד לעקוב אחר פרוטוקול IACUC המאושר שלך להרדמה.
8. הניחו את העכבר המרדים על התחתונים הרפואיים כשאפו מופנה ימינה ונשען על צדו השמאלי.
9. הסתכלו על העין הימנית של העכבר דרך המיקרוסקופ האופטלמי ופתחו את העפעפיים על-ידי פתיחת המלקחיים של מלקחיים בפעולה הפוכה משני צדי העין כדי לחשוף את אתר ההזרקה (איור 2C).
10. מלאו את מחט הנימים בתמיסה חיידקית Bacillus cereus (ATCC 14579) (דילול של 200 CFU/μL) על-ידי לחיצה שמאלית על משטח העכבר המחובר למיקרו-מזרק (איור 2D).
11. אבטחו את ראשו של בעל החיים ביד שמאל והניחו את קצה המחט בלימבוס של העין. כאשר המחט במצב שיקוע כלפי מעלה ובזווית של 45°, נקב את עין העכבר, אך ודא שרק הקצה החד של המחט (~ 0.5 מ"מ) מוכנס בעת ההזרקה.
12. לאחר החדרת קצה המחט, העבר את יד שמאל מראש העכבר אל משטח העכבר ולחץ לחיצה ימנית על משטח העכבר כדי להזריק 0.5 מיקרוליטר של דילול B. cereus שהוכן במרק עירוי לב מוחי (BHI). כדי למנוע דליפה, השאירו את קצה המחט בתוך עין העכבר למשך 2-3 שניות לפני ההסרה (איור 2E).
13. שחררו את המלקחיים והכניסו את העכבר לכלוב שיושב על משטח חימום. עקבו אחר העכברים האלה עד שהם התאוששו מהרדמה (איור 2F).
14. לאחר שהעכברים התאוששו מההרדמה, החזירו את הכלוב למתלה המתאים לו. אם העכברים יעברו ניתוח תפקודי רשתית על ידי אלקטרורטינוגרפיה, יש להחזיר את הכלובים לחדר חשוך לצורך הסתגלות חשוכה נכונה.

תוצאות

איור 1: יצירת מחטי זכוכית משופעות. מחטי זכוכית יוצרו מפיפטות מיקרו-נימיות חד פעמיות באמצעות מושך מחט/פיפטה ומשופע מיקרופיפטה. (A) צינור נימי זכוכית מהודק במושך המחט/פיפטה. (ב,ג) יצירת מחטי זכוכית באמצעות המתח הרצוי. (D) קיפול המיקרופיפטות מזכוכית. (ה,ו) מיקרופיפטות זכוכית לפני ואחרי שיקוע. (E) שינוי קנה המידה של מחטי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרו-מזרק תאים	מכשיר MicroData, Inc.	PM2000	נה
מיקרוקפילרים 5 מיקרוליטר	קימבל	71900-5	נה
מיקרו-פיפטה Beveler	סאטר אינסטרומנט ושות'	BV-10	נה
מיקרוסקופ OPMI Lumera	זיס		נה
מלקחיים לפעולה הפוכה	קטנה	K5-8228	נה