בדיקת כימות זיהום חיידקי: שיטה לכימות עומס חיידקי תוך עיני במודל עכבר של אנדופתלמיטיס חיידקית

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת צינור קציר

1. מניחים חרוזי זכוכית סטריליים בקוטר 1 מ"מ לתוך צינורות מכסה בורג בנפח 1.5 מ"ל.
2. לעקר צינורות אלה autoclave על הגדרה יבשה. יש להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
3. הוסף 10 מ"ל של 1x מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל.
4. יש להוסיף טבליה אחת של טבלית קוקטייל מעכבת פרוטאז לתוך הצינור. מערבבים על ידי מערבולת.
5. פיפטה 400 μL של 1x פוספט-buffered מלוחים (PBS) המכילים מעכב פרוטאז לתוך כל צינור קציר autoclaved. תייגו את הצינורות והניחו על קרח. (איור 1A).

2. קצירת העיניים

1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה בתנאי בטיחות ביולוגית רמה 2.
2. הרדימו את העכבר על ידי שאיפת_CO2. השתמש בשיטה משנית כדי לאשר המתת חסד.
3. החזיקו את ראש העכבר המורדם מאובטח ופתחו את המלקחיים העדינים משני צדי העין הנגועה. לדחוף כלפי מטה לכיוון הראש כדי proptose את העין. ברגע שהמלקחיים נמצאים מאחורי כדור הארץ, סחטו את המלקחיים זה לזה. משכו מלקחיים מהראש כדי לנתק את גלגל העין (איור 1B).
4. הכניסו מיד את גלגל העין לצינור קציר מסומן. הניחו צינורות על קרח למשך לא יותר מ-60 דקות (איור 1C).

3. ספירת חיידקים תוך עינית

1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה בתנאי בטיחות ביולוגית רמה 2.
2. אשרו שכל צינורות הקציר סגורים היטב ומאוזנים בזמן שהם נמצאים ברקמה הומוגנייזר (איור 2A). הפעל את ההומוגנייזר של הרקמה למשך דקה אחת כדי ליצור הומוגניזציה של הדגימות. המתן 30 שניות ולאחר מכן הפעל דקה נוספת. הניחו צינורות על קרח (איור 2B,C).
3. לדלל באופן סדרתי כל דגימה פי 10 על ידי העברה רציפה של 20 μL של הומוגנאט לתוך 180 μL של סטרילי 1x PBS. לדלל עד שמגיעים לפקטור של ^10-7 (איור 2D).
4. תייגו כל שורה של צלחת BHI חמה ומרובעת עם גורמי הדילול המתאימים. העבירו 10 μL מכל דילול בשורה לצלחת BHI העליונה המוטה כ-45°. הניחו לדגימה לרוץ עד שהיא כמעט מגיעה לתחתית הצלחת, ואז הניחו את הצלחת שטוחה (איור 2E).
5. כאשר הדגימה נספגת לתוך אגר BHI, להעביר את הצלחת לאינקובטור 37 מעלות צלזיוס. מושבות צריך להתחיל להיות גלוי 8 שעות לאחר הוצב באינקובטור.
6. הסירו את הצלחת מהאינקובטור לפני שצמיחת מושבות B. cereus תפריע לזיהוי מושבות בודדות (איור 2F).
7. לייצוג מדויק של הריכוז במדגם, ספרו את השורה שיש בה בין 10-100 מושבות. לדוגמה, שורה עם שבר דילול של ^10-4 שיש לה 45 מושבות תהיה בעלת ריכוז של 4.5 x 10⁵ CFU/mL.
8. כדי לחשב את המספר הכולל של חיידקים לכל עין, להכפיל את הריכוז ב 0.4, אשר מייצג את נפח מיליליטר של 1x PBS המשמש הומוגניזציה של העין. לדוגמה, ריכוז 4.5 x 10⁵ CFU/mL יתורגם ל- 1.8 x 10⁵ CFU B. cereus לכל עין.

איור 1: קצירת עין נגועה בעכבר. לאחר ההדבקה, לאחר נקודת הזמן הרצויה, קצרו עיני עכבר נגועות באמצעות פינצטה סטרילית. (A) PBS המכיל חרוזי זכוכית סטריליים. (ב) קצירת העין הנגועה. (C) צינור קציר המכיל עין עכבר.

איור 2: עיבוד העין שנקטפה לצורך ספירת חיידקים תוך עיניים. (A) צינור קציר עם עין נגועה מהודק בחוזקה להומוגנייזר רקמה. (B) עיניים נגועות עברו הומוגניות פעמיים למשך דקה אחת כל אחת. מעקב אחר דילול (D) של הומוגנאטים בעין (C) וציפוי עוקב (E) לכימות החיידקים. (E) מושבת Bacillus cereus אינדיבידואלית מייצגת לאחר דילול המסילה.