בדיקת כימות זיהום חיידקי: שיטה לכימות עומס חיידקי תוך עיני במודל עכבר של אנדופתלמיטיס חיידקית

תקציר

מקור: Mursalin, M. H. et al., הזרקה תוך ויטריאלית וכימות של פרמטרים של זיהום במודל עכבר של אנדופטלמיטיס חיידקי. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של כימות זיהום חיידקי מהומוגנאטים בעין המתקבלים ממודל מורין של אנדופתלמיטיס חיידקית הנגרמת על ידי Bacillus cereus. טכניקה זו מסייעת לחקור את התגובה החיסונית של המאכסן ואת תלותה בביטוי הגן החיידקי המארח והעין במודלים מורינים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת צינור קציר

1. מניחים חרוזי זכוכית סטריליים בקוטר 1 מ"מ לתוך צינורות מכסה בורג בנפח 1.5 מ"ל.
2. לעקר צינורות אלה autoclave על הגדרה יבשה. יש להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
3. הוסף 10 מ"ל של 1x מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל.
4. יש להוסיף טבליה אחת של טבלית קוקטייל מעכבת פרוטאז לתוך הצינור. מערבבים על ידי מערבולת.
5. פיפטה 400 μL של 1x פוספט-buffered מלוחים (PBS) המכילים מעכב פרוטאז לתוך כל צינור קציר autoclaved. תייגו את הצינורות והניחו על קרח. (איור 1A).

2. קצירת העיניים

1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה בתנאי בטיחות ביולוגית רמה 2.
2. הרדימו את העכבר על ידי שאיפת_CO2. השתמש בשיטה משנית כדי לאשר המתת חסד.
3. החזיקו את ראש העכבר המורדם מאובטח ופתחו את המלקחיים העדינים משני צדי העין הנגועה. לדחוף כלפי מטה לכיוון הראש כדי proptose את העין. ברגע שהמלקחיים נמצאים מאחורי כדור הארץ, סחטו את המלקחיים זה לזה. משכו מלקחיים מהראש כדי לנתק את גלגל העין (איור 1B).
4. הכניסו מיד את גלגל העין לצינור קציר מסומן. הניחו צינורות על קרח למשך לא יותר מ-60 דקות (איור 1C).

3. ספירת חיידקים תוך עינית

1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה בתנאי בטיחות ביולוגית רמה 2.
2. אשרו שכל צינורות הקציר סגורים היטב ומאוזנים בזמן שהם נמצאים ברקמה הומוגנייזר (איור 2A). הפעל את ההומוגנייזר של הרקמה למשך דקה אחת כדי ליצור הומוגניזציה של הדגימות. המתן 30 שניות ולאחר מכן הפעל דקה נוספת. הניחו צינורות על קרח (איור 2B,C).
3. לדלל באופן סדרתי כל דגימה פי 10 על ידי העברה רציפה של 20 μL של הומוגנאט לתוך 180 μL של סטרילי 1x PBS. לדלל עד שמגיעים לפקטור של ^10-7 (איור 2D).
4. תייגו כל שורה של צלחת BHI חמה ומרובעת עם גורמי הדילול המתאימים. העבירו 10 μL מכל דילול בשורה לצלחת BHI העליונה המוטה כ-45°. הניחו לדגימה לרוץ עד שהיא כמעט מגיעה לתחתית הצלחת, ואז הניחו את הצלחת שטוחה (איור 2E).
5. כאשר הדגימה נספגת לתוך אגר BHI, להעביר את הצלחת לאינקובטור 37 מעלות צלזיוס. מושבות צריך להתחיל להיות גלוי 8 שעות לאחר הוצב באינקובטור.
6. הסירו את הצלחת מהאינקובטור לפני שצמיחת מושבות B. cereus תפריע לזיהוי מושבות בודדות (איור 2F).
7. לייצוג מדויק של הריכוז במדגם, ספרו את השורה שיש בה בין 10-100 מושבות. לדוגמה, שורה עם שבר דילול של ^10-4 שיש לה 45 מושבות תהיה בעלת ריכוז של 4.5 x 10⁵ CFU/mL.
8. כדי לחשב את המספר הכולל של חיידקים לכל עין, להכפיל את הריכוז ב 0.4, אשר מייצג את נפח מיליליטר של 1x PBS המשמש הומוגניזציה של העין. לדוגמה, ריכוז 4.5 x 10⁵ CFU/mL יתורגם ל- 1.8 x 10⁵ CFU B. cereus לכל עין.

תוצאות

איור 1: קצירת עין נגועה בעכבר. לאחר ההדבקה, לאחר נקודת הזמן הרצויה, קצרו עיני עכבר נגועות באמצעות פינצטה סטרילית. (A) PBS המכיל חרוזי זכוכית סטריליים. (ב) קצירת העין הנגועה. (C) צינור קציר המכיל עין עכבר.

<...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-20 מיקרוליטר פיפטה	אנונימי	L0696003G	נה
חממת 37oC	פישר סיינטיפיק	11-690-625ד	נה
עירוי לב מוח Bacto	ב.ד.	90003-032	נה
מיקרו-מזרק תאים	מכשיר MicroData, Inc.	PM2000	נה
מלקחיים עדינים Thermo	פישר סיינטיפיק	12-000-122	נה
חרוזי זכוכית 1.0 מ"מ	BioSpec	11079110	נה
שייקר האינקובטור	ניו ברנזוויק סיינטיפיק	NB-I2400	נה
מיקרוקפילרים 5 מיקרוליטר	קימבל	71900-5	נה
מיקרו-פיפטה Beveler	סאטר אינסטרומנט ושות'	BV-10	נה
מיקרוסקופ Axiostar Plus	זיס		נה
מיקרוסקופ OPMI Lumera	זיס		נה
מיני-Beadbeater-16	BioSpec	דגם 607	נה
מחט / פיפטה מושך	קופף	730	נה
PBS	גיבקו	1897315	כיתה מולקולרית
קוקטייל מעכב פרוטאז	רוש	4693159001	כיתה מולקולרית
מלקחיים לפעולה הפוכה	קטנה	K5-8228	נה