זילוח ריאות Ex vivo: טכניקה לחקר ריאות במודל ארנב

תקציר

מקור: Pacheco-Baltazar, A., et al., Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מציג טכניקת ex vivo לזילוח ריאות מבודד. זהו כלי למחקר ריאתי שיסייע במחקרים של מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים המעורבים בהליכי השתלת ריאה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. קנולציה:

1. הניחו את ריאותיו של הארנב המבודד הטרי יחד עם הלב מעל גזה סטרילית על צלחת פטרי.
2. כדי למנוע atelectasis, לאוורר את הריאות באמצעות אוורור בלחץ חיובי עם לחץ סוף תפוגה חיובי (PEEP) מוגדר על 2 cmH₂O.
3. הסר את החדרים על ידי חיתוך אותם את הלב ברמה של החריץ אטריובנטריקולרי.
4. לאחר פתיחת שני החדרים, יש להציג את צינורית עורק הריאה OD 4.6 מ"מ עבור הארנב עם סל דרך עורק הריאה ולהציג את צינורית אטריום שמאל OD 5.9 מ"מ עבור הארנב עם הסל דרך המסתם המיטרלי לתוך אטריום שמאל.
5. השתמש בתפר משי 4-0 בעורק הריאה ובאטריום השמאלי כדי לתקן את הצינורית. כלול את הרקמות הסובבות בליגטורות של עורק הריאה והאטריום השמאלי כדי למנוע התנפחות של מבנים אלה.
6. להזריק 250 מ"ל של תמיסה איזוטונית מלוחים דרך צינורית העורקים כדי לשטוף את הדם שנותר ממיטת כלי הדם.

2. טכניקת זילוח:

1. ההתקנה:
   1. הניחו את הריאות המבודדות בזהירות לתוך תא הריאה.
   2. חבר את קנה הנשימה למתמר על מכסה החדר.
   3. חבר את כלי השימורים למערכת הזילוח.
   4. סגור את התא וחבר אותו באמצעות המנעול הסיבובי.
      הערה: מעגל הזילוח המחזורי מורכב ממאגר ורידי פתוח, משאבה פריסטלטית, מחליף חום ומלכודת בועות.
   5. בשלב זה, חברו את מכסה התא והחליפו סטופר כדי לעבור מאוורור לחץ חיובי לשלילי. כדי לבדוק את אוורור הלחץ השלילי של הריאות ואת הסגירה האטומה של החדר, לבדוק את הסיור הנשימתי של הריאה ולחץ החדר על מד הלחץ.
   6. לנקב את הריאות עם 200 מ"ל של פרפוזט מלאכותי ללא דם (חיץ ביקרבונט קרבס-רינגר המכיל 2.5% אלבומין בקר).
   7. התחל את זרימת הפרבוסט ב- 3 מ"ל/דקה/ק"ג, ולאחר מכן הגבר את הזרימה באיטיות במשך 5 דקות ל- 5 מ"ל/דקה/ק"ג. להגיע לזרימה של 8 מ"ל/דקה/ק"ג במהלך 5 הדקות הבאות ולאחר תקופה נוספת של 5 דקות להגיע לשטף מרבי של 10 מ"ל/דקה/ק"ג. דאג למנוע כניסת אוויר למעגל.
      הערה: לשמור על ה- pH ועל טמפרטורת הפרפוזט בטווח פיזיולוגי (pH 7.4-7.5; טמפרטורה, 37°C-38°C). כדי להתאים את ה- pH, הוסף NaHCO₃ (1N) או הגדל את זרימת הפחמן הדו-חמצני. לחלופין, השתמש HCl (0.1N) כדי להחמיץ.
2. פרמטרים:
   1. בדוק אם פרמטרי הזילוח והאוורור שנקבעו מראש מוגדרים כנדרש.
   2. אווררו את הריאות עם אוויר לח בתדר של 30 פעימות לדקה, נפח גאות של 10 מ"ל/ק"ג ולחץ פקיעת קצה (Pe) של 2 ס"מ ג'₂O.
      הערה: לחץ עורקי הריאה (0-20 מ"מ כספית) מתאים לגובה רמת הנוזל במחמצן או במאגר בסנטימטרים מעל תא המטען הריאתי, ואילו הלחץ ורידי הריאתי מתאים לגובה תא איזון הלחץ מעל האטריום השמאלי. ניתן לשנות את שני הערכים. שים לב כי לחץ אטריום שמאל הוא גם 0-20 מ"מ כספית.
3. השגת תנאי Zone 3:
   1. השתמש בשני הצנתרים המחוברים ליציאות צדדיות של הצינורית המאובטחות בעורק הריאה, אטריום שמאלי, ומתמרי לחץ כדי למדוד את הלחצים העורקיים (Pa) והוורידיים (Pv).
   2. הגדר את הלחצים הבסיסיים ברמה של הילום הריאה (אפס ייחוס).
   3. בצע את הניסויים בתנאי אוורור של אזור 3. כדי להשיג זאת, המתן 10-15 דקות כדי לקבל שיווי משקל המאופיין במצב איזוגרבימטרי.
   4. ודא שהלחץ הורידי גבוה מהלחץ הנאדי (Palv) והלחץ העורקי נשאר גבוה משניהם (Pa > Pv > Palv) כדי שתנאי Zone 3 יתרחשו.
   5. ודא שמשקל הריאות נשאר קבוע ולחצים עורקיים ופרוזדורים שמאליים יציבים כדי להשיג תנאי אזור 3 לפתיחת מספר מרבי של כלי דם ריאתיים ושמירה על תכולת המיטה המיקרו-וסקולרית במהלך הניסוי.
      הערה: למדידת Kfc כאינדיקטור לבצקת ריאות אין שונות בין מערכת זילוח ידנית ואוטומטית.
4. בקרה אלקטרונית ועיבוד אותות: ודא כי זרימת הנשימה, שינויי משקל, לחץ כלי דם, נפח הגאות, התנגדות כלי הדם, בין היתר, רשומים על יחידת אלקטרוניקה מרכזית מרובים המשלבת אותות המגיעים מהמתמרים ומציגה אותם במערכת ההערכה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורות 2-Stop Tygon E-Lab, ID, 12/pack, שחור/לבן	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-1864
מתאם לאוורור בלחץ חיובי ב- IPL-4	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-4312
מתאם לאוורור בלחץ חיובי ב- IPL-4	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-4312
אספקת גז חלופית ללא לחץ עבור IPL-4: לספק לקנה הנשימה תערובת גזים שונה מאוויר החדר במהלך אוורור שלילי	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-4309
יחידת בסיס לארנב לחזיר עוברי ריאה מבודדת מחוררת	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-4138
סרום בקר A2: D41אלבומין אבקה lyophilized	סיגמא	3912	500 גרם
סידן כלורי, CaCl2·2H2O.	ג'יי.טי בייקר	10035-04-8
בקבוקונים קריוגניים	קורנינג	430659	2 מ"ל
D-גלוקוז, C6H12O6.	סיגמא	G5767
מתמר דיפרנציאל בלחץ נמוך DLP2.5, טווח +- 2.5 cmH2O, מחבר HSE	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-3882
מתמר לחץ דיפרנציאלי MPX, טווח +- 100 cmH2O, מחבר HSE	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-0064
צינורות אפנדורף
אתנול מוחלט HPLC כיתה	קלדון
צינורות בז			14 מ"ל
משאבה פריסטלטית של הרווארד P-230 (עם תיבת בקרה והנעה מוטורית P-230)	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	70-7001
Pneumotachometer ליניארי מחומם 0 עד 10 ליטר / דקה טווח זרימה	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	59-9349
בקר חימום עבור פנאומוטכומטר יחיד 230 וולט AC , 50 הרץ	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	59-9703
הפארין	פיזה		ממשק משתמש 5000
עמוד HPLC (C18 100A 5U)	אולטק	98121213	150 מ"מ x 4.6 מ"מ
מסנן מזרק הידרופילי	מילקס	SLLGR04NL	4 מ"מ
מערכת ליבה IPL-4 לריאה מבודדת של ארנב לחזיר עוברי, 230	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-4296
מערכת ליבה IPL-4 עבור ארנב מבודד לריאה חזיר עוברי, 230 V	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-4296
מאגר זכוכית ז'קט לתמיסת חיץ, עם פריט ואבובים, 6.0 ליטר	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-0322
מחזור תרמוסטטי Lauda, סוג E-103, 230 וולט/50 הרץ, נפח אמבטיה 3 ליטר, טווח טמפרטורות 20 עד 150°C	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-0125
קנולה אטריום שמאלית לארנב עם סל, OD 5.9 מ"מ	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-4162
מתמר לחץ דם לטווח נמוך P75 עבור מודול PLUGSYS	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-0020
מגנזיום גופרתי heptahydrate, MgSO4·7H2O	ג'יי.טי בייקר	10034-99-8
צינור מיקרוצנטריפוגה	קורנינג	430909
אפשרות בקרת אוורור בלחץ שלילי עם וסת לחץ עבור IPL-4	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-4298
ארנבים בניו זילנד
PISABENTAL (נתרן Pentobarbital)	פיזה	Q-7833-215
מארז PLUGSYS, סוג 603* 7	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-0045
מודול מונה זמן PLUGSYS TCM	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-1750
מודול מגבר מתמר PLUGSYS (TAM-A)	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-0065
מודול מגבר מתמר PLUGSYS (TAM-D)	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-1793
מודול בקרת אוורור PLUGSYS VCM-4R עם וסת לחץ	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-1755
אשלגן כלורי, KCl.	ג'יי.טי בייקר	3040-01
אשלגן דימימן פוספט, KH2PO4	ג'יי.טי בייקר	7778-77-0
צינורית עורק ריאתי לארנב עם סל, OD 4.6 מ"מ	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-4161
בקר סרוו לזילוח (SCP	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-2806
צינור מיקרוצנטריפוגה Snap Cap	כוכב משנה	3620	1.7 מ"ל
סודיום ביקרבונט, NaHCO3	סיגמא	S6014
נתרן כלורי, NaCl.	סיגמא	S9888
כפפות כירורגיות מס' 7 1/2
כפפות כירורגיות מס' 8
צינורות טייגון	מאסטרפלקס
קנולה קנה הנשימה לארנב, OD 5.0 מ"מ	הוגו זקס אלקטרוניק (HSE)	73-4163