הכנת מודל ארנב מודע לווידאו סימולטני - EEG-ECG-אוקסימטריה-קפנוגרפיה להתערבויות ניסיוניות: הליך להשתלת אלקטרודות EEE-ECG וחיבור בדיקות נשימה במודל ארנב

תקציר

מקור: Bosinski, C. et al., ניטור רב-מערכתי לזיהוי התקפים, הפרעות קצב ודום נשימה בארנבים מרוסנים מודעים. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים את ההליך להשתלת אלקטרודות EEG-ECG וחיבור בדיקות נשימה במודל ארנב לרכישה וניתוח רשומות של האותות הביולוגיים שלו.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. השתלת אלקטרודות EEG-ECG והצמדת מוניטורים נשימתיים

1. הוציאו ארנב אחד מהמוביל והניחו בחיקו של חוקר יושב.
2. החזיקו את הארנב במאונך והחזיקו אותו קרוב לגופו של החוקר.
3. הורידו את הארנב למצב שכיבה, כאשר ראשו של הארנב מונח על ברכיו של החוקר, וראשו של הארנב נמוך יותר משאר גופו.
   הערה: תמרון זה מרגיע את החיה וממזער את הסבירות שהיא תנסה לזוז או לברוח תוך כדי הצבת האלקטרודות.
4. כעת, כשהארנב מאובטח במצב שכיבה, בקשו מחוקר נוסף לפזר את הפרווה עד שניתן יהיה לזהות את העור ולבודד אותו מהרקמה שמתחתיו.
5. הכנס אלקטרודות כפופות של 35° באופן תת-עורי בכל בית שחי (איור 1A).
   הערה: יש לדחוף את האלקטרודות כך שהן מחוברות היטב לעור, אך אינן חודרות למבנים עמוקים יותר. כניסה ואז יציאה של האלקטרודה מהעור (דרך ודרך) מפחיתה את הסיכוי שהמוליכים יתנתקו כאשר מניחים את הארנב ברסן או אם הוא זז במהלך הניסוי (איור 1B). כל האלקטרודות מעוקרות עם 70% אתנול לפני המיקום.
6. המקום מוביל על החזה האחורי לגפיים הקדמיות הימניות והשמאליות ועל הבטן הקדמית לגפה האחורית השמאלית. הניחו אלקטרודת סיכה קרקעית קדמית לגפה האחורית הימנית על הבטן (איור 2A).
7. לאחר שכל מוליכי האק"ג ממוקמים כראוי, החזירו את הארנב למצב נוטה, כאשר הלידים רצים בצד אחד של בטן הארנב, והעבירו את הארנב לרסן בגודל מתאים (למשל, 6 אינץ' x 18 אינץ' x 6'). בעת הנחת הארנב בריסון, משוך את החוט הרופף כלפי מעלה כדי למזער את הארנב מלמשוך את האלקטרודות עם רגליו. הדביקו את החוטים לצד הרסן כדי שהם לא ייתפסו מתחת לארנב במהלך הניסוי (איור 2B).
8. אבטחו את הארנב ברסן על ידי הורדת הרסן סביב הצוואר ונעילתו למקומו. בנוסף, הזיזו את הגפיים האחוריות למעלה מתחת לחיה והדקו את הריסון האחורי.
   הערה: אחד צריך להיות מסוגל להתאים 1-2 אצבעות בתוך החלל מתחת לצוואר כדי להבטיח שזה לא הדוק מדי. במיוחד במהלך ניסויים שבהם עשויה להיות תנועה מוטורית, חשוב להדק את הרסן כדי למזער תנועה, פציעות אפשריות בעמוד השדרה, פריקת גפיים והיכולת לבעוט החוצה את הריסון האחורי (איור 2B). ארנבים נשמרו בריסן במשך ~ 5 שעות ללא בעיות הקשורות לתנועה מוגברת או סימני התייבשות.
   1. עבור ארנבים קטנים (למשל, פחות מחודשיים) הניחו כרית הגבהה גומי מתחת לחיה כדי להרים את הארנב למעלה, מה שמונע מהארנב להניח את צווארו על החלק התחתון של משענת הראש (איור 2C).
      הערה: ירידה פתאומית בקצב הנשימה והלב עשויה להיות משנית לפגיעה בצוואר. אם זה קורה, שחררו את ריסון הצוואר והרימו את ראש הארנב כדי להקל על דחיסת הצוואר.
   2. כאשר הריסון האחורי אינו עוקב מקרוב אחר הגב/עמוד השדרה של הארנב, מקם מרווח PVC כדי למנוע כל תזוזה שעלולה לגרום לפגיעות בעמוד השדרה.
      הערה: לדוגמה, צינור PVC בקוטר פנימי של ~14 ס"מ x 4 אינץ', כאשר ניתן להסיר את 25-33% התחתונים מעל הארנב עם קצף כדי לספק ריסון מתאים (איור 2C).
9. כעת, כשהארנב ממוקם היטב בתוך הרסן, הכניסו לקרקפת אלקטרודות סיכה ישרות בקוטר 7-13 מ"מ (איור 1A). באמצעות גישה של זווית כניסה של 45°, העבירו את החוטים בין האוזניים, וקשרו באופן רופף את החוטים לרסן מאחורי הראש כדי לשמור על מיקום העופרת. מקום 5 מוליך EEG במיקומים הבאים: קדמי ימני, קדמי שמאלי, עורפי ימני, עורפי שמאלי ומוביל ייחוס מרכזי (Cz) בנקודה שבין 4 המובילים האחרים (איור 2D).
   הערה: אלקטרודות ממוקמות כראוי כאשר הן ממוקמות ברקמה תת עורית כנגד הגולגולת. מיקום זה ממזער חפצים מהאף, האוזניים ושרירים אחרים שמסביב. חלק מהחפץ מתנועת האף הקצבית הוא בלתי נמנע. מוליכי ה- EEG הקדמיים צריכים להיות ממוקמים מדיאלי לעיני הארנב ומצביעים קדימה. המוליכים העורפיים צריכים להיות ממוקמים קדמיים לאוזניים ויצביעו לכיוון המדיאלי. Cz ממוקם במרכז החלק העליון של הראש בנקודה שהיא בין כל 4 האלקטרודות (באמצע הדרך בין Lambda ו Bregma, לאורך קו התפרים). הסיכה של אלקטרודת Cz מצביעה קדימה.
   1. העבירו את חוטי ה-EEG בין האוזניים, כדי למנוע מהארנב לנסות לנשוך את החוטים.
10. חבר את plethysmograph אוקסימטר הדופק לאוזן הארנב מעל וריד האוזן השולי.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך לגלח שיער עודף מהאוזן כדי לשפר את האות או להשתמש קצת גזה כדי לשמור על החיישן במקום.
    1. ודאו שקצב הלב בפלטיסמוגרפיה תואם לקצב הלב מהאק"ג, ושרוויון החמצן מוצג (איור 3C).
11. הניחו בעדינות את מסכת הפנים עם צינורות קפנוגרפיה על הפה והאף של הארנב (איור 2H). הדקו את מסכת הפנים באמצעות חוט כרוך סביב המסכה וחברו את שני קצוות החוט לרסן. חבר את הקצה השני של צינורות הקפנוגרפיה לצג הסימנים החיוניים.
    הערה: חשוב למנוע מהחוט להניח על עיני הארנב במהלך הניסוי. לשם כך, הדביקו את החוט לאמצע הרסן בין אוזני הארנב. כדי לשפר את אות הקפנוגרפיה, צרו שסתום חד-כיווני באמצעות סרט הדבקה וחתיכה דקה של ניטריל שיאפשרו לחמצן להיכנס לחתיכת ה-T, ויכוונו CO2 נשוף לתוך צינור הקפנוגרפיה (איור 2I).

2. הקלטה של וידאו-EEG-ECG

1. בצע הקלטת וידאו-EEG-ECG באמצעות תוכנת EEG זמינה מסחרית.
   הערה: הלידים והווידאו בעלי הפוטנציאל הביולוגי נעולים בזמן כדי להתאים מאוחר יותר בין אותות החשמל והווידאו (למשל, ספייק EEG עם אידיוט מיוקלוני).
2. אשר קישוריות מיטבית, ללא סטייה מקו הבסיס, ללא רעש חשמלי של 60 הרץ ויחס אות לרעש גבוה. באופן ספציפי, ודא כי כל שלב של צורת גל הלב ניתן לדמיין על ECG וכי גלי דלתא, תטא ואלפא אינם מוסתרים חזותית על ידי רעש בתדר גבוה על EEG.
   1. אם כל האלקטרודות מייצרות כמויות מוגזמות של רעש, התאם את מוליך הייחוס המרכזי. אם רק אלקטרודה אחת רועשת יתר על המידה, דחפו את האלקטרודה עמוק יותר לתוך העור או מקמו אותה מחדש עד שלא תיחשף מתכת.
3. התאימו את הווידאו כך שניתן יהיה לראות את כל הארנבים בו זמנית, מה שמאפשר מתאם של פעילות מוטורית עם ממצאי EEG (איור 3A).
   הערה: המערכת מכילה הקלטות EEG/ECG/oximetry/capnography בו זמנית מעד 7 ארנבים.
4. התחל את ההקלטה הבסיסית מכל חיה למשך מינימום של 10-20 דקות או עד שקצב הלב מתייצב למצב רגוע ורגוע (200-250 פעימות לדקה) והארנבים אינם מפגינים תנועות גדולות במשך 5 דקות לפחות. קבל נתונים אלקטרוגרפיים ברוחב פס מלא ללא מסננים. כדי להמחיש נתונים בצורה טובה יותר, הגדר את מסנן התדר הנמוך (=מסנן מעבר גבוה) ב- 1 הרץ ואת מסנן התדר הגבוה (=מסנן מעבר נמוך) ב- 59 הרץ.
   הערה: סימן נוסף לכך שהארנב רגוע הוא הופעת צירי שינה EEG (נדון בהמשך).
5. הוסף הערות נעולות בזמן בזמן במהלך הניסוי בזמן אמת כדי לציין את העיתוי של התערבויות (למשל, אספקת תרופות) ואירועים נוירו-לבביים (למשל, ספייק EEG, התקפים מוטוריים, פעימות חוץ רחמיות והפרעות קצב), וממצאים מוטוריים/חוקרים.
   הערה: בשל התדירות שבה החוקר צריך להפעיל התערבות (למשל, גירוי פוטי, אספקת סמים), כדי למזער את הלחץ של חוקר להיכנס ולצאת מהחדר ולפתוח / לסגור את הדלת, החוקר נשאר בצד השני של החדר לאורך כל הניסוי. החוקר יושב רחוק ככל האפשר מבעל החיים, ונשאר דומם ושקט כדי למזער את ההפרעה הפוטנציאלית לבעלי החיים.

תוצאות

איור 1: תמונה של אלקטרודות EEG ואק"ג. (A) אלקטרודות אק"ג כפופות ואלקטרודות EEG ישרות. (B) כיצד לחבר את אלקטרודת האק"ג ברקמה התת-עורית של הארנב, כך שהיא תהיה דרך ודרך. קיצורים (LL: גפה שמאלית, RA: זרוע ימין, RL: גפה ימנית, LA: זרוע שמאל, RF: חזיתית ימנית, LF: חזיתית שמאלית, Cz: מרכז, RO: עורפית ימנית, LO: עורפית שמאלית).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מחשב	Dell	אופטיפלקס 5040	מחשב רכישה
אלקטרודת אק"ג	רית'מלינק	RLSND116-2.5	13 מ"מ 35 מעלות כפוף (0.4 מ"מ קוטר) אלקטרודות פין תת-עורי
אלקטרודת EEG	רית'מלינק	RLSP513	אלקטרודות תת-עוריות בעלות 5 פיתולים בקוטר 13 מ"מ ישר (קוטר 0.4 מ"מ)
EEGLAB (2020)	מרכז שוורץ למדעי המוח החישוביים	גישה פתוחה	יכול לבצע ניתוח ספקטרלי של EEG
מתאם Ethernet-to-Ethernet	לינקסיס	USB3G16	מתאם לחיבור המצלמה למחשב
ריפוד קצף	כללי	לא ישים	מפחית את הלחץ המופעל על צווארם של ארנבים קטנים על ידי הרסן על מנת למנוע את ההשפעות cardiorespiratory שליליות של דחיסת הצוואר
MATLAB (R2019b, עדכון 5)	מת'וורקס	לא ישים	נדרש להפעלת EEGLAB
מיקרופון	סטריאו סוני	ECM-D570P	הקלטה של ביטויים קוליים של התקפים
סרט רפואי מיקרו-נקבוביות, נייר, לבן	3 דקות	1530-1	משמש לאבטחת חוטים וליצירת סד אוזניים
Natus NeuroWorks	נאטוס	LC101-8	תוכנות רכישה וסקירה
ממריץ פוטי	דשא	PS22	מגרה כדי לשלוט בתדר, עיכוב, משך, עוצמת פולסי האור
מארגן / צרור חוטי פלסטיק	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	צרור חוטים כדי לצמצם את הרעש
PS 22 ממריץ פוטי	כלי דשא	BZA641035	אור מהבהב עם תדר, השהיה ועוצמה מתכווננים של המבזק
צינור PVC	כללי	לא ישים	מונע מארנבים קטנים לבעוט ברגליהם האחוריות ולגרום לפגיעה בעמוד השדרה
ריסון ארנב	Plas-Labs	501-TC	ניתן להשיג מעצורי ארנבים בגדלים שונים. 6" x 18" x 6" במחקר זה.
פד גומי (בוסטר)	כללי	לא ישים	מרים ארנבים קטנים למעלה במרסן כדי למנוע דחיסת צוואר
SpO2 אטב אוזניים	נונין	61000	PureSAT/SpO2
מתאם חיישן SpO2	נונין	13931	XPOD PureSAT/SpO2
Webcol אלכוהול הכנה, סטרילי, גדול, 2-רובד	קובידיאן	5110	להכנת וריד האוזן לפני הצנתור
LabChart Pro (2019, גרסה 8.1.16)	אדינסוטרמנטים	לא ישים	ניתוח אק"ג
מגבר קוונטי	נאטוס	13926	מגבר / דיגיטציה
מגבר Quantum HeadBox	נאטוס	22134	תיבת פיצול של 64 פינים
מצלמת SRG-X120 1080p PTZ עם יציאת HDMI, IP ו-3G-SDI	סוני	SRG-X120	מצלמת אימפלה