בידוד תאי IPE ו-RPE: טכניקה להשגת תאי אפיתל פיגמנט עיני מעין ארנב

תקציר

מקור: Bascuas, T., et al. בידוד, תרבית והנדסה גנטית של תאי אפיתל פיגמנטיים ראשוניים של יונקים לטיפול גנטי לא ויראלי. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה אנו מראים הליך להשגת תאי אפיתל פיגמנט עיני ממודל ארנב. התאים מסייעים בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למחלות ניווניות ברשתית.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

ארנבים לבנים בניו זילנד הומתו על ידי מנת יתר של Pentobarbital (150 מ"ג / ק"ג) מדולל ב 0.9% NaCl מוזרק intraperitoneal ואת העיניים היו enucleed מיד לאחר הקרבה.

1. לפני ההכנה

1. הכינו מדיום מלא (DMEM/Ham's F12 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 80 U/mL פניצילין / 80 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 2.5 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין B). יש לחמם את הרמה הבינונית, 1x PBS ו-0.25% טריפסין (במידת הצורך) באמבט מים של 37°C.
2. הכניסו וילון סטרילי למכסה המנוע כדי להכין מקום עבודה אספטי. הכנס את כל המכשירים והחומרים הסטריליים הדרושים בתוך מכסה המנוע.
   הערה: רק שאיבת העיניים וניקוי רקמת השריר והעור שנותרו הם ההליכים המתבצעים מחוץ למכסה המנוע, שאר השלבים חייבים להתבצע בתוך מכסה המנוע.

2. בידוד תאי PE של ארנב

1. השתמש מספריים מעוקלים ומלקחיים קוליברי כדי לחנך את העיניים לאחר המתת חסד החיה. נקו את רקמת השריר והעור הנותרים מהעיניים באמצעות מספריים ומלקחיים (לא סטריליים).
   הערה: גודל המספריים והמלקחיים שמשמשים לחינוך ולניקוי העיניים תלוי במין (למשל, עבור חולדה ועכבר המכשירים יהיו קטנים יותר מאלה שמשמשים לחזיר ובקר) (ראו איור 1).
   1. לאסוף את העיניים בצינור 50 מ"ל מלא PBS לא סטרילי ולהעביר את הצינור למכסה המנוע זרימה למינרית. יש לחטא את העיניים על ידי טבילה למשך 2 דקות בתמיסה על בסיס יוד, ולאחר מכן להעביר אותן לצלחת פטרי מלאה PBS סטרילי.
2. פתיחת הנורה
   1. שים עין אחת על דחיסת גזה סטרילית והחזק אותה בחוזקה קרוב לעצב הראייה. לפתוח את העין עם אזמל #11 מספריים על 2 מ"מ מתחת לימבוס. מוציאים את המקטע הקדמי (קרנית, עדשה וקשתית) ומכניסים אותו לצלחת פטרי. השאירו את הנורה עם הזגוגית עד לבידוד תאי RPE.
3. בידוד תאי IPE
   1. הסירו את העדשה ובעזרת מלקחיים עדינים שלפו בעדינות את הקשתית המכילה את תאי ה-IPE. מניחים את הקשתית בצלחת פטרי, שוטפים עם PBS סטרילי ומשאירים אותה ב-PBS עד להכנת קשתית נוספת. הסר את הגוף הרירי מן הקשתית על ידי חיתוך עם אזמל #10.
   2. לאחר הכנת 2 קשתית, לדגור עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין ב 37 ° C במשך 10 דקות; במהלך תקופה זו, תאי RPE ניתן לבודד (ראה שלב 2.4). מוציאים את הטריפסין ומוסיפים 1 מ"ל מדיום שלם לקשתית ומבודדים את התאים על ידי גירוד בזהירות עם פיפטת פסטר שטוחה מלוטשת אש. השהה מחדש את התאים בזהירות על ידי צנרת ולהעביר את תרחיף התא לתוך צינור 1.5 מ"ל. קח 10 μL של תרחיף התא ודלל 1:3 עם כחול טריפאן כדי לספור את התאים בתא נויבאואר.
   3. אם לא נדבקים מיד, זרעו 200,000 תאים/באר בצלחת של 24 בארות (100,000 תאים/ס"מ²) ב-1 מ"ל של תווך שלם (10% FBS) (לזריעה ראו טבלה 1). מניחים את הצלחת באינקובטור ומגדלים אותה בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לאחד כמה עיניים יחד כדי שיהיו מספיק תאים לזריעה.
4. בידוד תאי RPE
   1. הסר הומור זגוגית ורשתית מהקטע האחורי עם מלקחיים דקים. הימנע מפגיעה באפיתל פיגמנט הרשתית.
   2. שים גזה סטרילית לתוך צלחת 12 באר ולשים את הנורה מעל גזה.
   3. יש לשטוף עם PBS. הוסף 50 μL של 0.25% טריפסין לכל עין ודגור במשך 10 דקות ב 37 ° C. להסיר טריפסין ולהוסיף 150 μL של מדיום מלא לכל כדור הארץ ולגרד את תאי RPE בעדינות עם פיפטה פסטר מעוקל אש; השתמש במלקחיים עדינים כדי לשתק את הרקמה. לאסוף את השעיית התא ולשים אותו בצינור 1.5 מ"ל. קח 10 μL של השעיית התא; לדלל 1:4 עם כחול טריפאן כדי לספור את התאים בתא נויבאואר.
   4. צנטריפוגה את התאים 10 דקות ב 120 x גרם.
   5. אם לא נדבקים מיד, זרעו 200,000 תאים/באר בצלחת של 24 בארות (100,000 תאים/ס"מ²) ב-1 מ"ל של תווך שלם (10% FBS) (לזריעה ראו טבלה 1). מניחים את הצלחת באינקובטור ומגדלים אותה בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לאחד כמה עיניים יחד כדי שיהיו מספיק תאים לזריעה.

תוצאות

מינים	טיפול בטריפסין	תאי IPE N°	תאי RPE N°	צלחת זריעה (100,000 תאים/ס"מ2)
ארנב	כן	~350,000	~2,500,000	צלחות 24 בארות

טבלה 1: מספר תאי PE...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות 12 בארות	קורנינג	353043
צלחות 24 בארות	קורנינג	353047
בטדין	מונדיפארמה
בון מיקרו מלקחיים שטוח
מלקחיים קוליברי (סטרילי)
DMEM/Ham's F12	סיגמא-אולדריץ'	D8062
וילונות (סטריליים)	Mölnlycke Health Care	800530
פ.ב.ס.	ברונשוויג	עמ' 40-37500
מלקחיים (גודל שונה) (סטרילי)
דחיסת גזה	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium ד"ר Bichsel AG	1000090
תא נויבאואר	מרינפלד-סופיריור	640010
פיפטה פסטר (פוליש אש)	וויטג	4100150
PBS 1X	סיגמא-אולדריץ'	D8537
פניצילין/סטרפטומיצין	סיגמא-אולדריץ'	P0781-100
פנטוברביטל (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
צלחת פטרי	תרמופישר סיינטיפיק	150288
סקרפל מספר 10, אילת	סוואן-מורטון	501
סקרפל מספר 11, אילת	סוואן-מורטון	503
קצה חד-חד מעוקל במיוחד דק בון מספריים (סטרילי)
קצה חד ישר אקסטרה דק בון מספריים (סטרילי)
טריפסין 0.25%	תרמופישר סיינטיפיק	25050014
מספריים קפיציים של Vannas מעוקלים (סטריליים)