בידוד תאי IPE ו-RPE: טכניקה להשגת תאי אפיתל פיגמנט עיני מעין ארנב

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

ארנבים לבנים בניו זילנד הומתו על ידי מנת יתר של Pentobarbital (150 מ"ג / ק"ג) מדולל ב 0.9% NaCl מוזרק intraperitoneal ואת העיניים היו enucleed מיד לאחר הקרבה.

1. לפני ההכנה

1. הכינו מדיום מלא (DMEM/Ham's F12 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 80 U/mL פניצילין / 80 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 2.5 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין B). יש לחמם את הרמה הבינונית, 1x PBS ו-0.25% טריפסין (במידת הצורך) באמבט מים של 37°C.
2. הכניסו וילון סטרילי למכסה המנוע כדי להכין מקום עבודה אספטי. הכנס את כל המכשירים והחומרים הסטריליים הדרושים בתוך מכסה המנוע.
   הערה: רק שאיבת העיניים וניקוי רקמת השריר והעור שנותרו הם ההליכים המתבצעים מחוץ למכסה המנוע, שאר השלבים חייבים להתבצע בתוך מכסה המנוע.

2. בידוד תאי PE של ארנב

1. השתמש מספריים מעוקלים ומלקחיים קוליברי כדי לחנך את העיניים לאחר המתת חסד החיה. נקו את רקמת השריר והעור הנותרים מהעיניים באמצעות מספריים ומלקחיים (לא סטריליים).
   הערה: גודל המספריים והמלקחיים שמשמשים לחינוך ולניקוי העיניים תלוי במין (למשל, עבור חולדה ועכבר המכשירים יהיו קטנים יותר מאלה שמשמשים לחזיר ובקר) (ראו איור 1).
   1. לאסוף את העיניים בצינור 50 מ"ל מלא PBS לא סטרילי ולהעביר את הצינור למכסה המנוע זרימה למינרית. יש לחטא את העיניים על ידי טבילה למשך 2 דקות בתמיסה על בסיס יוד, ולאחר מכן להעביר אותן לצלחת פטרי מלאה PBS סטרילי.
2. פתיחת הנורה
   1. שים עין אחת על דחיסת גזה סטרילית והחזק אותה בחוזקה קרוב לעצב הראייה. לפתוח את העין עם אזמל #11 מספריים על 2 מ"מ מתחת לימבוס. מוציאים את המקטע הקדמי (קרנית, עדשה וקשתית) ומכניסים אותו לצלחת פטרי. השאירו את הנורה עם הזגוגית עד לבידוד תאי RPE.
3. בידוד תאי IPE
   1. הסירו את העדשה ובעזרת מלקחיים עדינים שלפו בעדינות את הקשתית המכילה את תאי ה-IPE. מניחים את הקשתית בצלחת פטרי, שוטפים עם PBS סטרילי ומשאירים אותה ב-PBS עד להכנת קשתית נוספת. הסר את הגוף הרירי מן הקשתית על ידי חיתוך עם אזמל #10.
   2. לאחר הכנת 2 קשתית, לדגור עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין ב 37 ° C במשך 10 דקות; במהלך תקופה זו, תאי RPE ניתן לבודד (ראה שלב 2.4). מוציאים את הטריפסין ומוסיפים 1 מ"ל מדיום שלם לקשתית ומבודדים את התאים על ידי גירוד בזהירות עם פיפטת פסטר שטוחה מלוטשת אש. השהה מחדש את התאים בזהירות על ידי צנרת ולהעביר את תרחיף התא לתוך צינור 1.5 מ"ל. קח 10 μL של תרחיף התא ודלל 1:3 עם כחול טריפאן כדי לספור את התאים בתא נויבאואר.
   3. אם לא נדבקים מיד, זרעו 200,000 תאים/באר בצלחת של 24 בארות (100,000 תאים/ס"מ²) ב-1 מ"ל של תווך שלם (10% FBS) (לזריעה ראו טבלה 1). מניחים את הצלחת באינקובטור ומגדלים אותה בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לאחד כמה עיניים יחד כדי שיהיו מספיק תאים לזריעה.
4. בידוד תאי RPE
   1. הסר הומור זגוגית ורשתית מהקטע האחורי עם מלקחיים דקים. הימנע מפגיעה באפיתל פיגמנט הרשתית.
   2. שים גזה סטרילית לתוך צלחת 12 באר ולשים את הנורה מעל גזה.
   3. יש לשטוף עם PBS. הוסף 50 μL של 0.25% טריפסין לכל עין ודגור במשך 10 דקות ב 37 ° C. להסיר טריפסין ולהוסיף 150 μL של מדיום מלא לכל כדור הארץ ולגרד את תאי RPE בעדינות עם פיפטה פסטר מעוקל אש; השתמש במלקחיים עדינים כדי לשתק את הרקמה. לאסוף את השעיית התא ולשים אותו בצינור 1.5 מ"ל. קח 10 μL של השעיית התא; לדלל 1:4 עם כחול טריפאן כדי לספור את התאים בתא נויבאואר.
   4. צנטריפוגה את התאים 10 דקות ב 120 x גרם.
   5. אם לא נדבקים מיד, זרעו 200,000 תאים/באר בצלחת של 24 בארות (100,000 תאים/ס"מ²) ב-1 מ"ל של תווך שלם (10% FBS) (לזריעה ראו טבלה 1). מניחים את הצלחת באינקובטור ומגדלים אותה בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לאחד כמה עיניים יחד כדי שיהיו מספיק תאים לזריעה.

טבלה 1: מספר תאי PE ראשוניים שבודדו מעיני ארנב.

איור 1: מכשירים שמשמשים לבידוד PE כתלות במין. (A) מכשירים לא סטריליים המשמשים לשאיבת העיניים ולניקוי רקמת השריר והעור שנותרו. סט 1 משמש לחולדה, עכבר וארנבת, וסט 2 משמש לעיני חזיר ובקר. (B) מכשירים סטריליים המשמשים לבידוד PE. שימו לב לגודל השונה של מספריים ומלקחיים המשמשים בהתאם לגודל העיניים. פיפטות פסטר עגולות ושטוחות מלוטשות באש משמשות לגירוד של RPE ו- IPE, בהתאמה.