בידוד תאי IPE ו-RPE: טכניקה להשגת תאי אפיתל פיגמנטיים מעין חזירית מבודדת

תקציר

מקור: Bascuas T. et al., בידוד, תרבית והנדסה גנטית של תאי אפיתל פיגמנטיים ראשוניים של יונקים לטיפול גנטי לא ויראלי. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה אנו מתארים טכניקה לבידוד תאי אפיתל קשתית ופיגמנט רשתית מעיני חזירים כדי להשיג את התרביות הראשוניות שלהם למחקרי in vivo ו- ex vivo. תאי פיגמנט אלה יכולים להיות מהונדסים גנטית כדי לחקור גישות רגנרטיביות לטיפול בהפרעות עיניים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. לפני ההכנה

1. הכינו מדיום מלא (DMEM/Ham's F12 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 80 U/mL פניצילין / 80 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 2.5 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין B). יש לחמם את הרמה הבינונית, 1x PBS ו-0.25% טריפסין (במידת הצורך) באמבט מים של 37°C.
2. הכניסו וילון סטרילי למכסה המנוע כדי להכין מקום עבודה אספטי. הכנס את כל המכשירים והחומרים הסטריליים הדרושים בתוך מכסה המנוע.
   הערה: רק שאיבת העיניים וניקוי רקמת השריר והעור שנותרו הם ההליכים המתבצעים מחוץ למכסה המנוע, שאר השלבים חייבים להתבצע בתוך מכסה המנוע.
3. עיני חזיר נלקחו מבית מטבחיים מקומי תוך 6 שעות מרגע ההקרבה והועברו למעבדה על קרח

2. בידוד תאי PE חזיריים

1. השתמש מספריים מעוקלים ומלקחיים קוליברי כדי לחנך את העיניים לאחר המתת חסד החיה. נקו את רקמת השריר והעור הנותרים מהעיניים באמצעות מספריים ומלקחיים (לא סטריליים).
   הערה: גודל המספריים והמלקחיים שמשמשים לחינוך ולניקוי העיניים תלוי במין (למשל, עבור חולדה ועכבר המכשירים יהיו קטנים יותר מאלה שמשמשים לחזיר ובקר) (ראו איור 1).
   1. לאסוף את העיניים בצינור 50 מ"ל מלא PBS לא סטרילי ולהעביר את הצינור למכסה המנוע זרימה למינרית. יש לחטא את העיניים על ידי טבילה למשך 2 דקות בתמיסה על בסיס יוד, ולאחר מכן להעביר אותן לצלחת פטרי מלאה PBS סטרילי.
   2. לאחר העברת העיניים לצלחת פטרי סטרילית, החזיקו אחת מהן קרוב בחוזקה לעצב הראייה בעזרת קוליברי או מלקחיים מחודדים. נקבו חור קרוב לגבול הקשתית (בין pars plana ל-ora serrata) בעזרת מחט 18 גרם. מכניסים מספריים קטנים לחור וחותכים סביב הקשתית. מוציאים את המקטע הקדמי (קרנית, עדשה וקשתית) ומכניסים אותו לצלחת פטרי. השאירו את הנורה עם הזגוגית עד לבידוד תאי RPE.

3. בידוד תאי IPE

1. הסר את הגוף הרירי מן הקשתית על ידי חיתוך עם אזמל #10. לאחר הכנת 2 קשתית, מוסיפים 1 מ"ל של מדיום מלא ומבודדים את התאים על ידי גירוד בזהירות עם פיפטה שטוחה מלוטשת אש. העבר את תרחיף התא לתוך צינור 1.5 מ"ל. קח 10 μL של תרחיף התא ודלל 1:4 עם כחול טריפאן כדי לספור את התאים בתא נויבאואר.
2. אם לא נדבקים מיד, זרעו 200,000 תאים/באר בצלחת של 24 בארות (100,000 תאים/ס"מ²) ב-1 מ"ל של תווך שלם (10% FBS) (לזריעה ראו טבלה 1). מניחים את הצלחת באינקובטור ומגדלים אותה בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך לאחד כמה עיניים יחד כדי שיהיו מספיק תאים לזריעה.

4. בידוד תאי RPE

1. בצע את שלב 1.1.1. מניחים את הנורה בצלחת פטרי ושוטפים עם PBS. ממלאים את הנורה במדיום שלם של 1 מ"ל.
2. בעזרת פיפטת פסטר מעוקלת ומלוטשת אש, מסירים בזהירות תאי RPE. הקפידו לגרד מלמטה למעלה כדי למנוע החלקה מטה של קומפלקס הממברנות של כורואיד-ברוך. אספו את תרחיף התא בתוך הנורה באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר והעבירו לצינור של 1.5 מ"ל לצורך השעיה. קח 10 μL של תרחיף התא ודלל 1:8 עם כחול טריפאן כדי לספור את התאים בתא נויבאואר.
3. תאי זרע כמתואר בשלב 3.2.

תוצאות

מינים	טיפול בטריפסין	תאי IPE N°	תאי RPE N°	צלחת זריעה (100,000 תאים/ס"מ2)
חזיר	לא	~1,000,000	~3,000,000	צלחות 24 בארות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות 12 בארות	קורנינג	353043
צלחות 24 בארות	קורנינג	353047
בטדין	מונדיפארמה
בון מיקרו מלקחיים שטוח
מלקחיים קוליברי (סטרילי)
DMEM/Ham's F12	סיגמא-אולדריץ'	D8062
פ.ב.ס.	ברונשוויג	עמ' 40-37500
מלקחיים (גדלים שונים) (סטרילי)
NaCl (0.9%)	Laboratorium ד"ר Bichsel AG	1000090
מחט (18G)	תרומו	TER-NN1838R
תא נויבאואר	מרינפלד-סופיריור	640010
פיפטה פסטר (פוליש אש)	וויטג	4100150
PBS 1X	סיגמא-אולדריץ'	D8537
פניצילין/סטרפטומיצין	סיגמא-אולדריץ'	P0781-100
צלחת פטרי	תרמופישר סיינטיפיק	150288
סקרפל מספר 10, אילת	סוואן-מורטון	501
סקרפל מספר 11, אילת	סוואן-מורטון	503
קצה חד-חד מעוקל במיוחד דק בון מספריים (סטרילי)
קצה חד ישר אקסטרה דק בון מספריים (סטרילי)
ציטומטר מבוסס תמונה טלי	תרמופישר סיינטיפיק	T10796
טריפסין 0.25%	תרמופישר סיינטיפיק	25050014
טריפסין 5%/EDTA 2%	סיגמא-אולדריץ'	T4174
מספריים קפיציים של Vannas מעוקלים (סטריליים)