מודל הקרנית Porcine Ex vivo של קרטיטיס חיידקית: טכניקה ליצירת זיהום חיידקי בתאי אפיתל בקרנית

תקציר

מקור: Okurowska, K., et al. הקמת מודל קרנית חזיר Ex Vivo לחקר טיפולים תרופתיים נגד קרטיטיס חיידקית. J. Vis. Exp (2020).

סרטון זה מתאר פרוטוקול להגדרת מודל ex vivo לקרטיטיס חיידקית באמצעות כפתור corneoscleral שנותח מהעין החזירית. חיידקים מחוסנים חוצים את חתכי אפיתל הקרנית כדי לפלוש לסטרומה הבסיסית וליצור זיהום בתוך רקמות הקרנית המחקה את זיהום in vivo.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE

1. הכנת חיסון

1. יוצקים 10 מ"ל של מרק LB לתוך בקבוק חרוטי 50 מ"ל עם פקק קצף.
2. מעבירים מושבה של זן P. aeruginosa PAO1 או זן PA14 מצלחת אגר טרייה ודגורים בטמפרטורה של 37°C למשך 3-4 שעות עד שהחיידקים נמצאים בשלב אמצע הלוג.
3. מעבירים את תרבית החיידקים לצינור של 50 מ"ל ולצנטריפוגה במהירות של 3,000 x גרם למשך 5 דקות. מוציאים את הסופרנאטנט ומרחפים מחדש את כדורית התא ב-PBS.
4. חזור על שלב 1.3 פעמיים נוספות כדי לשטוף את התאים. השהה מחדש את כדורית התא ב- PBS וכוונן את הצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר לכ- 0.6 באמצעות PBS סטרילי כריק.

2. הדבקת כפתור corneoscleral

1. הסר מדיה מצלחת פטרי ושטוף קרניות פעמיים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי.
2. סחטו בעדינות את המלקחיים תוך החזקת הקרנית בין לבין. השתמש באזמל 10A כדי לבצע ארבעה חתכים - שניים אנכיים, שניים אופקיים - בחלק המרכזי של הכפתור הקורנאוסקרלי דרך שכבת האפיתל אל הסטרומה שמתחת.
3. מניחים תבנית זכוכית סטרילית בצלחת 6 בארות עם החלק הרחב למעלה ומניחים את הקרנית במרכז תבנית הזכוכית, צד אפיתל פונה כלפי מטה. בצעו את החיתוך ממש במרכז החלק התחתון של תבנית הזכוכית.
4. שלב קריטי: יוצקים 1 מ"ל של 1% (w/v) נקודת התכה נמוכה אגר מומס DMEM כדי למלא את תבנית הזכוכית עם הקרנית לחלוטין.
5. הניחו לאגר להתייצב ולאחר מכן הפכו את תבנית הזכוכית כך שאפיתל הקרנית פונה כלפי מעלה.
6. פיפטה 15 μL של תרבית חיידקים עם OD_600nm = 0.6 (עבור P. aeruginosa זה שווה בערך 1 x 10⁷ יחידות יוצרות מושבה (CFU) ב 15 μL) ישירות לתוך אזור חתך ולאחר מכן להוסיף 85 μL של PBS למעלה כדי לשמור על אפיתל הקרנית לח. מדללים את תרבית החיידקים הנותרת ואת הצלחת על אגר כדי לספור יחידות יוצרות מושבה עבור החיסון.
7. הוסף 1 מ"ל של DMEM ללא אנטיביוטיקה לתחתית כל באר עם תבנית זכוכית. לדגור על צלחת 6 בארות עם כפתורים corneoscleral נגוע באינקובטור לח ב 37 ° C עם 5% CO₂ עד 24 שעות.
8. הגדירו קרנית ביקורת לא נגועה לצד כל ניסוי. כדי להגדיר בקרה לא נגועה, החלף את 15 μL של תרבית חיידקים בשלב 2.6 עם PBS סטרילי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
50 מ"ל צינור פלקון	SLS	352070
אמפוטריצין ב	סיגמא	A2942
סלסטאר 12 צלחת באר	גריינר ביו-וואן	665180
דקסטרן	סיגמא	31425-100 מ"ג-פ'
דיסטל	פישר סיינטיפיק	12899357
DMEM + גלוטמקס	SLS	D0819
אינקובטור תנור כפול	SLS	OVe1020	חיטוי תנור
גורם גדילה אפידרמיס	SLS	E5036-200UG
F12 חזיר	סיגמא	N4888
נסיוב עגל עובר	לאבטק הבינלאומי	CA-115/500
מלקחיים	פישר סיינטיפיק	15307805
Heracell VIOS 160i	תרמו סיינטיפיק	15373212	אינקובטור תרביות רקמה
אינסולין, רקומביננטי אנושי	SLS	91077C-1G
ל.ב. אגר	סיגמא	L2897
מולטיטרון	אינפורס	לא ישים	אינקובטור חיידקי
PBS	SLS	עמ' 4417
פניצילין-סטרפטומיצין	SLS	P0781
צלחת פטרי	פישר סיינטיפיק	12664785
צלחת פטרי 35x10mm CytoOne	סטארלאב	CC7672-3340
פובידון יוד	בית מרקחת Weldricks	2122828
בטוח 2020	פישר סיינטיפיק	1284804	ארון בטיחות למיקרוביולוגיה סוג II
להב אזמל מספר 15	פישר סיינטיפיק	O305
אזמל סוואן מורטון	פישר סיינטיפיק	11849002