מודל ריאות חזיר Ex vivo של ביופילם: טכניקה לפיתוח מודל ריאות לחקר ביופילמים חיידקיים על רקמת ברונכיולר חזיר

תקציר

מקור: Harrington, N.E. et al., בדיקת יעילות אנטיביוטית במודל Ex vivo של Pseudomonas aeruginosa ו- Staphylococcus aureus Biofilms ב- Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לפיתוח מודל ריאות חזיר ex vivo של ביופילם חיידקי על רקמת סימפונות נגועה. ביופילמים הם אגרגטים חיידקיים המשובצים במטריצה הנצמדת למשטח. מודל זה משמש לחקר הרגישות האנטיביוטית של חיידקים בשלבים שונים של היווצרות ביופילם.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. דיסקציה וזיהום של רקמת ריאות חזיר ex vivo (EVPL)

1. הפוך SCFM לשימוש עם רקמת EVPL, בצע את המתכון עבור 1 L שונה SCFM שסופק בטבלה 1.
2. לפני הנתיחה, הכינו צלחת אגר / ים של זני חיידקים נדרשים לזיהום באמצעות כל אגר סטנדרטי במעבדה עבור P. aeruginosa/S. aureus (למשל, מרק ליזוגני + 1.2% אגר).
3. חשב כמה חתיכות רקמה ברונכיולריות חזיריות נדרשות לניסוי, כולל חתיכות רקמת ביקורת לא נגועות. הכפל מספר זה בשניים כדי לחזור על הניסוי בשתי ריאות משוכפלות כדי לאשר את יכולת החזרה של התוצאות.
4. הכפל את המספר הכולל של חתיכות רקמה הנדרשות ב- 0.5 כדי לקבוע את נפח האגרוז SCFM (מ"ל) הדרוש לייצור רפידות אגרוז כדי ליצור מספיק מדיום עבור 400 מיקרוליטר / פיסת רקמה בתוספת אגר SCFM רזרבי כדי לקחת בחשבון שגיאות צנרת או אידוי במהלך ההכנה.
5. הוסף 0.12 גרם אגרוז לכל 15 מ"ל של SCFM הדרוש כדי להפוך את הנפח הכולל הרצוי של SCFM עם 0.8% משקל/נפח אגרוז.
6. מחממים את תמיסת האגרוז SCFM עד שהאגרוז מומס במלואו. מומלץ להשתמש במיקרוגל ביתי בעוצמה נמוכה. הזמן הנדרש תלוי בהספק של המיקרוגל. מניחים לאגרוז להתקרר לכ-50 מעלות צלזיוס (חם למגע אך נוח לאחיזה). אין לאפשר להתקרר עוד.
7. בעזרת פיפטה, מוסיפים 400 μL של אגרוז SCFM לבאר אחת של צלחת 24 בארות לכל פיסת רקמה נדרשת.
8. יש לעקר את ה-SCFM המכיל אגרוז עם 24 בארות תחת אור אולטרה סגול למשך 10 דקות.
9. הכינו שלוש שטיפות משוכפלות לכל ריאה שלמה שנותחה באמצעות 20 מ"ל של מדיום הנשר הסטרילי של דולבקו (DMEM) בתוספת 20 מ"ל של מכון הזיכרון הסטרילי רוזוול פארק (RPMI) 1640 בתוספת אמפיצילין של 50 מיקרוגרם/מ"ל
.
10. בצע aliquot של 40 מ"ל SCFM כמו שטיפה סופית עבור כל ריאה שלמה להיות מנותח. ניתן לאחסן את כל השטיפות למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C או להשתמש בהן מיד.
11. יש להשיג ריאות מהמקור המיועד בהקדם האפשרי לאחר השחיטה, ולוודא שהן נשמרות קרות על ידי הובלה למעבדה בקופסת קירור ביתית.
    הערה: ריאות קרובות יותר ליום השחיטה מראות פחות שטפי דם מהאחסון, אך ניתן להשתמש גם ברקמות שנשמרות באחסון קר עד 4 ימים מהשחיטה. מכיוון שיש לקחת את קופסת הקירור לאטליז או לבית המטבחיים, יש לטהר אותה בהתאם להנחיות המעבדה המקומית לאחר כל שימוש ולאחסן מחוץ למעבדה המיקרוביולוגית כאשר אינה בשימוש, כדי להפחית את הסיכון לזיהום ולהפרת הכלה.
12. עובדים על משטח מעוקר ומתחת ללהבה, מניחים את הריאות על קרש חיתוך פלסטיק נקי מכוסה ברדיד אלומיניום אוטוקלאב. בדוק כי bronchioles להישאר שלם. אם נגרם נזק בבית המטבחיים או במהלך ההובלה, הריאות אינן מתאימות לשימוש.
13. מחממים סכין פלטה מתחת ללהבה ונוגעים בסכין לזמן קצר באזור הריאה המקיפה את הסמפונות כדי לעקר את פני השטח של הרקמה.
14. חתכו את רקמת פני השטח המקיפה את הסמפונות באמצעות סכין גילוח סטרילי. בצע חתכים במקביל הסמפונות כדי למנוע נזק.
15. לאחר שהסימפונות נחשפו, בצע חתך חתך דרך הסמפונות בנקודה הגבוהה ביותר הנראית לעין כדי לשחרר את הסמפונות.
16. באמצעות מלקחיים סטריליים, החזיקו קלות את הקצה החופשי של הסמפונות וחתכו כל רקמה לא רצויה שנותרה באמצעות סכין גילוח סטרילי. בצע חתך חתך סופי על פני הסמפונות לפני כל הסתעפות גלויה כדי להסיר את הסמפונות מהריאות.
17. הניחו את הסמפונות בשטיפת DMEM/RPMI 1640 הראשונה. השאירו את הסמפונות בשטיפה וחזרו על שלבים 1.12 עד 1.15 כדי לקצור חלקים נוספים של סימפונות מאותה ריאה כנדרש כדי להניב מספיק חלקי רקמה לניסוי המתוכנן.
18. הכניסו לכביסה חלקים ברונכיולריים נוספים מאותה ריאה (שלב 1.17). השאירו בכביסה למשך 2 דקות לפחות.
19. מוציאים את הסימפונות מהשטיפה הראשונה של DMEM/RPMI 1640 ומניחים את הדגימות בצלחת פטרי סטרילית.
20. החזיקו כל סימפונות קלות באמצעות מלקחיים סטריליים, והקפידו לא לפגוע ברקמה. הסר כמה שיותר רקמה רכה שנותרה וחתך את הרקמה לרצועות ~ 5 מ"מ ברוחב באמצעות מספריים סטריליים לדיסקציה.
21. הכניסו את כל רצועות הרקמה הסימפונות לשטיפת DMEM/RPMI 1640 השנייה. השאירו בכביסה למשך 2 דקות לפחות.
22. מוציאים את רצועות הרקמה מהשטיפה השנייה באמצעות מלקחיים סטריליים, תוך הקפדה שלא לפגוע ברקמה. הניחו את הרקמה בצלחת פטרי נקייה וסטרילית.
23. הסר את כל הרקמה הרכה שנותרה המחוברת לסימפונות וחתך את הרצועות לריבועים (~ 5 מ"מ x 5 מ"מ) באמצעות מספריים סטריליים.
24. הוסיפו את השטיפה השלישית של DMEM/RPMI 1640 לצלחת הפטרי. מערבבים קלות את חתיכות הטישו בכביסה על ידי ערבול המנה.
25. יוצקים את השטיפה השלישית מתוך צלחת פטרי מבלי להסיר את חתיכות הרקמה.
26. הוסיפו את שטיפת ה-SCFM הסופית לצלחת הפטרי המכילה רקמות, וודאו שכל חלקי הרקמה מכוסים.
27. יש לעקר את חלקי הרקמה ב-SCFM תחת אור UV למשך 5 דקות.
28. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר כל פיסת רקמה סימפונות מעוקרת לתוך בארות בודדות של צלחת / s 24 בארות המכילות רפידות אגרוז SCFM.
29. כדי להדביק כל פיסת רקמה בזן החיידקי הרצוי, געו במושבה שגדלה על צלחת אגר עם קצה מחט 29 גרם המחוברת למזרק אינסולין סטרילי של 0.5 מ"ל. לאחר מכן גע במושבה על פיסת הרקמה, דוקר בעדינות את משטח הרקמה.
    הערה: שימוש במזרק אינסולין המצויד במחט 29 גרם מאפשר להחזיק את המחט בצורה מדויקת ונוחה תוך שמירה על האצבעות במרחק בטוח הן מהמחט והן מרקמת הריאה. ניתן לבצע שלב זה באמצעות מחטים 29 G שאינן מחוברות למזרק, אך הדבר דורש מיומנות רבה יותר ומגדיל את הסיכון לפגיעה במחט. מזרקי אינסולין זמינים.
30. עבור בקרות לא נגועות, לדקור בעדינות את פני השטח של כל אחד מחלקי הרקמה עם קצה של מחט 29 G מחובר מזרק אינסולין סטרילי 0.5 מ"ל.
31. השתמש פיפטה כדי להוסיף 500 μL של SCFM לכל באר.
32. יש לעקר קרום איטום נושם לכל צלחת בת 24 בארות תחת אור אולטרה סגול למשך 10 דקות (טבלת חומרים).
33. הסירו את המכסה/ים מהצלחות בנות 24 הקידוחים והוחלפו בקרום הנושם.
34. לדגור על הצלחות ב 37 ° C עבור זמן הדגירה הרצוי (זיהום) מבלי לרעוד. בדוק שאין גידול נראה לעין של הפתוגן המחוסן על חלקי הבקרה הלא נגועים (בקרת זיהום).
    הערה: במידת הצורך, ניתן להוסיף אמפיצילין לפדים של אגרוז SCFM ולכסות SCFM בשלב 1.31 לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/מ"ל. זה ידכא את הצמיחה של רוב החיידקים האנדוגניים על הריאות מבלי להשפיע על צמיחת P. aeruginosa או S. aureus, אבל, כמו נוכחות של ampicillin עשוי להשפיע על רגישות אנטיביוטיקה אחרים, הקורא נשאר לעשות את הבחירה הזאת בהתאם זנים אנטיביוטיקה הם רוצים לבדוק.

טבלה 1

1. הכנת מדיה סינתטית של כיח CF (SCFM) לשימוש עם מודל ריאות חזיר ex vivo

לאחר ייצורו, יש לעקר את ה-SCFM, ולאחר מכן לאחסן אותו בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש.

a) מתכון עיקרי
שלב 1	כימי	כמות	הוראות	mM סופי ב-1L SCFM
	NaCl	3.03 גרם	להוסיף מלחים ומים לבקבוק נקי, המשמש רק להכנת SCFM	51.85
	KCl	1.114 גרם		14.94
	dH2O	640 מ"ל		לא ישים
שלב 2	כימי	טוחנות של מלאי המיוצר במים, מעוקר בסינון ומאוחסן ב-4°C	הוראות	mM סופי ב-1L SCFM
	Na2HPO4	0.125 מ'	מוסיפים 10 מ"ל מכל ציר למלחים ומים שהוכנו בשלב 1	1.25
	NaH2PO4	0.13 מטר		1.30
	NH4Cl	0.228 מ'		2.28
	KNO3	0.0348 מ'		0.35
	K2SO4	0.0271 מ'		0.27
	MOPS	1 מטר		10.00
שלב 3	כימי		הוראות	mM סופי ב-1L SCFM
	19 תמיסות חומצות אמינו שהוכנו לפי סעיף ב')		הוסף 10 מ"ל מכל ציר לתמיסה שהוכנה בשלבים 1 ו -2.	ראה סעיף ב)
שלב 4	כימי		הוראות	mM סופי ב-1L SCFM
	HCl או NaOH כנדרש		השתמש כדי להתאים את רמת החומציות של התמיסה שהוכנה בשלבים 1-3 עד 6.8. רשום נפח של חומצה / בסיס הוסיף.	לא ישים
שלב 5	כימי		הוראות	mM סופי ב-1L SCFM
	dH2O		יש להוסיף לתמיסה שהוכנה בשלבים 1-4, לנפח סופי של 960 מ"ל	לא ישים
שלב 6	כימי	טוחנות של מלאי המיוצר במים, מעוקר בסינון ומאוחסן ב-4°C	הוראות	mM סופי ב-1L SCFM
	CaCl2	0.175 מ'	הוסף 10 מ"ל מכל ציר לתמיסה שהוכנה בשלבים 1-5	1.75
	MgCl2	0.0606 מ'		0.61
שלב 7	כימי	טוחנות של מלאי המיוצר במים, מעוקר בסינון ומאוחסן ב-4°C	הוראות	mM סופי ב-1L SCFM
	L-חומצה לקטית	0.93 מ'	לייצר מלאי במים, pH עד 7 עם 5M NaOH. הוסף 10 מ"ל לתמיסה שהוכנה בשלבים 1-6.	9.30
שלב 8	כימי	מולאריות של מלאי עבודה שנעשה במים, מיד לפני הוספת המתכון	הוראות	mM סופי ב-1L SCFM
	Fe(III)SO4.7H2O	0.00036 מ'	הכינו נייר אב בנפח 0.036 מ', שניתן לעקר ולסנן בטמפרטורה של 4°C כל עוד התמיסה נשארת נקייה משקעים. כדי ליצור את מלאי העבודה, הוסף 110 μl של מלאי האב ל- 9.890 מ"ל dH2O והוסף את מלאי העבודה לתמיסה שהוכנה בשלבים 1-7.	0.0036

b) הכנת מלאי חומצות אמינו; יש לעקר את המסנן לפני השימוש ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
חומצת אמינו	מניית mM	הוראות	mM סופי ב 1 L SCFM
אלנין	178	מתמוססים במים	1.780
ארגינין	30.6	מתמוססים במים	0.306
אספרטט	82.7	מתמוססים ב-0.5 מ' NaOH	0.827
ציסטאין	16	מתמוססים במים	0.160
חומצה גלוטמית	154.9	מתמוססים ב-1M HCl	1.549
גליצין	120.3	מתמוססים במים	1.203
היסטידין	51.9	מתמוססים במים	0.519
איזולאוצין	112.1	יש להמיס במים על ידי חימום ל-50°C למשך 30 דקות על שייקר	1.121
לאוצין	160.9	מתמוססים במים	1.609
ליזין	212.8	מתמוססים במים	2.128
מתיונין	63.3	מתמוססים במים	0.633
אורניתין-הידרוכלוריד	67.6	מתמוססים במים	0.676
פנילאלנין	53	מתמוססים במים	0.530
פרולין	166	מתמוססים במים	1.660
סרין	144.6	מתמוססים במים	1.446
תראונין	107.2	מתמוססים במים	1.072
טריפטופן	1.3	מתמוססים ב-0.2 מ' NaOH	0.013
טירוזין	80.2	מתמוססים ב-1M NaOH	0.802
ולין	111.7	מתמוססים במים	1.117

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזרקי אינסולין - 0.5 מ"ל עם מחט 29G מחוברת.	VWR	BDAM324892
צלחות תרבות 24 בארות
70% אתנול או דומה לעיקור פני שטח והבערת ציוד דיסקציה
צלחות אגר להכנת פסים של P. aeruginosa/S. aureus (כל מדיום מתאים)
אגרוז
רדיד אלומיניום - מעוקר מראש על ידי autoclaving - כדי לכסות את קרש החיתוך שעליו אתה לנתח ריאות.
ממברנת איטום קלה לנשימה או קלה יותר לנשימה עבור צלחות מרובות בארות	ביוטכנולוגיה מגוונת	BEM-1 או BERM-2000
מבער בונזן
קרש חיתוך - אנו ממליצים על קרש פלסטיק כדי לאפשר חיטוי קל עם אלכוהול.
קופסת קירור להובלת ריאות למעבדה
מספריים לדיסקציה בגדלים שונים
מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)
סכין משטחים גדולה
סכיני גילוח רכובים
צלחות פטרי
קרש חיתוך פלסטיק ורדיד אלומיניום ליצירת משטח דיסקציה סטרילי וניתן לניקוי
מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 בינוני
SCFM			המרכיבים כמפורט בטבלה 1
בחירת מלקחיים (מומלץ טיפים קהים)
מיכלים מתאימים לסילוק חדים מזוהמים ורקמת ריאה חזירית, על פי של המוסד שלך מדיניות בריאות ובטיחות.