כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הגדרת מקטעים קדמיים בצלחות תרבית איברים
- מניחים מקטע קדמי יחיד (AS) בצלחת פטרי עם AS הפוך (למעלה). בעזרת צמר גפן, יש להרטיב במדיה ולטפוח בעדינות במרכז הקרנית כדי להסיר פיגמנט. בעזרת מלקחיים כדי להחזיק את העין ואת אותו מקלון, לנגב את צמר גפן סביב לובן העין כדי להסיר פיגמנט נוסף.
- הופכים את ה-AS ומניחים על החלק התחתון של המנה מעל האזור המוגבה, תוך ריכוז הקרנית מעל האזור המוגבה בצלחת. הניחו את טבעת ההידוק על גבי ה-AS.
- הניחו ארבעה ברגים לתוך החורים המתאימים כדי להחזיק את הטבעת במקומה עם ה-AS מתחת לטבעת. הדקו בעדינות את הברגים ביד עם מקש L.
הערה: שלב ההידוק יתרחש מדי יום לאורך כל הניסוי, ולכן מטרת ההידוק הראשוני כאן היא להבטיח שהתקשורת לא תדלוף תוך הימנעות משבירת טבעת ההידוק .
- בעזרת סט כלי פטרי סטרילי, מניחים את החלק העליון מעל המנה והופכים את ההתקנה. מצרפים את עמדת הכלים. חבר את המחברים הזורמים עם אורינגים ליציאות מושחלות בתחתית הצלחת.
- למחבר נוזלי אחד, חבר רכזת מחט כפופה 18 G 90°, אורך צינור, רכזת מחט 18 G, מסנן מזרק ניילון, שסתום תלת-כיווני ומזרק 20 מ"ל מלא במדיה.
- למחבר הנוזלי השני, חבר רכזת מחט כפופה של 18 G 90 מעלות, אורך הצינור, רכזת מחט 18 G, שסתום תלת-כיווני וחלק החבית של מזרק סטרילי של 10 מ"ל (זה ישמש כמאגר לתפיסת נוזלים ובועות מה- ASOC).
- עם שסתומים תלת-כיווניים הפתוחים כראוי למזרקים, דחפו בעדינות מדיה דרך המערכת באמצעות יציאת מחבר הפלואידיקה שזוהתה בשלב 1.5 כדי לנפח את ה- AS, למלא את המדיה בצינורית, ובסופו של דבר את המאגר.
הערה: אם התקשורת דולפת לתוך צלחת ASOC, AS אינו מאובטח מספיק חזק עם טבעת הידוק .
- מוציאים את הבועות על ידי דחיפת מדיה עדינה לתוך הצלחת והיפוך הצלחת כדי לדחוף את הבועות החוצה לתוך המאגר.
- מניחים את המנה ועומדים זקופים. הניחו את החלק התחתון של צלחת פטרי מתחת לרגלי המעמד, נזהרים שלא ללכוד את הצינור.
2. התחלת תרבית איברים בקטע הקדמי
- ASOC מוכן כעת לדגירה. הכניסו את צלחת ASOC לאינקובטור תרבית התאים (37°C, 5% CO2). ודא שגובה צלחת ASOC באינקובטור מעל מתמרי הלחץ ידוע ונחשב לחישוב לחץ תוך עיני (IOP) במדויק.
- כוונו את קווי הצינור החוצה דרך תחתית דלת האינקובטור 37°C, 5% CO2 כך שלא יפריעו לפתיחה ולסגירה של הדלת. חבר את המזרק בנפח 20 מ"ל למשאבת המזרק במהירות של 2.5 מיקרוליטר/דקה.
- מקם את קו הצינור עם המאגר במכשיר מתמר הלחץ. חבר את השסתום התלת-כיווני הצדדי למערך מתמר הלחץ תוך כדי זרימת PBS דרך הקו כדי למנוע כניסת בועות אוויר לקווי הצינור.
הערה: רוקן את PBS מהמאגרים לאחר הקמת המערכת כדי להפחית את הסבירות לזיהום המאגרים עם גידול מיקרוביאלי למשך תרבית האיברים.
- התחל איסוף נתוני IOP על ידי הבטחת כרטיס microSD קיים לשמירת קבצי נתונים. לאחר מכן, הפעל את הגדרת מתמר הלחץ כדי להתחיל באיסוף נתונים.
3. תחזוקה יומית של ASOC
- לאחר של- ASOC היו 24 שעות לאיזון, הסר את הכלים מאינקובטור 37 ° C, 5% CO2 והנח אותם בארון הבטיחות הביולוגית (BSC) II.
הערה: באיסוף נתוני לחץ, פרקי זמן אלה נראים כמו עליות חדות כאשר ה- ASOCs מוסרים מהאינקובטור (שינוי גובה) ומותאמים בארון.
- בדקו אם יש נזילות מתחת לכל צלחת בצלחת הפטרי. אם קיימים, בדקו אם יש חיבורים נוזליים הדוקים מתחת לצלחת ומהדקים מחדש במידת הצורך. בדוק אם יש נזילות בחלק העליון של הצלחת באמצעות מפתח L סטרילי כדי להדק את הברגים בטבעת ההידוק .
הערה: רקמת סקלרה AS תדחס ותפחית את העובי ב -24 שעות, ויהיה צורך להדק את טבעת ההידוק .
- שאפו את התקשורת מהמנה היטב.
הערה: רשת הטרבקולר מסננת נוזל מהמדיה הנשאבת לתוך ASOC. לכן, המדיה תהיה נוכחת בצלחת ASOC לאורך הקצוות.
- חזור על שלבים 1.7 ו- 1.8 כדי להסיר בועות אוויר לכודות.
- מלאו מחדש מזרקים על משאבות המזרק, ודאו שמשאבות המזרקים פועלות, ואשרו את יישור השסתומים לזילוח לתוך ה- ASOC. להחזיר את צלחת ASOC ל 37 ° C, 5% CO2 אינקובטור.
הערה: באופן אופטימלי, צעדים אלה צריכים להתבצע מדי יום. עם זאת, השימוש בנפח התחלתי של מדיה של 20 מ"ל, נפח באר צלחת ASOC וקצב משאבה של 2.5 מיקרוליטר לדקה אמור להספיק כדי לאפשר למערכת לפעול במשך מספר ימים ללא הפרעה.
