יצירת פרוסות חדריות חזיריות: טכניקה מבוססת ויברטומים להכנת פרוסות דקות במיוחד של רקמת לב חזיר

תקציר

מקור: Ou, Q. et. al., חיתוך וטיפוח לבבות חזירים בתנאים פיזיולוגיים. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים הליך מבוסס ויברטומים ליצירת חלקים דקים במיוחד של לב חזיר. פרוסות הרקמה המוכנות ניתנות לתרבית ומשמשות כמערכות מודל לבדיקות פרמקולוגיות.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. חיתוך רקמת לב חזיר

1. הגדר את אמבט הרקמות על הוויברטום, הוסף קרח למעיל קירור אמבט הרקמות, ולאחר מכן הוסף את התמיסה של טיירוד לאמבט הרקמות. הגדר צנצנת פלסטיק 1 ליטר כדי לאסוף את סילוק הקרח המומס ממעיל קירור אמבט הרקמות. עבור 1 ליטר של תמיסת חיתוך Tyrode, לערבב 3 גרם / L 2,3-butanedione monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 גרם), 6 mM KCl (0.447 גרם), 10 mM D-גלוקוז (1.86 גרם), 10 mM HEPES (2.38 גרם), 1 mM MgCl₂ (1 מ"ל של 1 M תמיסה), 1.8 mM CaCl₂ (1.8 מ"ל של 1 M פתרון), עד 1 ליטר של ddH₂O. כוונן את ה- pH ל- 7.40 באמצעות NaOH. לאחר מכן, סנן את התמיסה באמצעות מסנן ואקום/מערכת אחסון בנפח 1,000 מ"ל, 0.22 מיקרומטר, ואחסן בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
2. מתחת לארון הבטיחות הביולוגית, העבירו את לב החזיר למגש המכיל 1 ליטר של תמיסה קרדיופלגית קרה טרייה. עבור 1 ליטר של תמיסה cardioplegic, לערבב 110 mM NaCl (6.43 גרם), 1.2 mM CaCl₂ (1.2 מ"ל של 1 M תמיסה), 16 mM KCl (1.19 גרם), 16 mM MgCl₂ (3.25 גרם), 10 mM NaHCO₃ (0.84 גרם), 1 U/mL הפרין, עד 1 L של ddH₂O. כוונן את ה- pH ל- 7.40 באמצעות NaOH. לאחר מכן, סנן את התמיסה באמצעות מסנן ואקום/מערכת אחסון בנפח 1,000 מ"ל, 0.22 מיקרומטר, ואחסן בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
   הערה: הוסף 1,000 U/L הפרין בתמיסת קרדיופלגיה ביום החיתוך.
3. לנתח את הלב כדי לבודד את החדר השמאלי באמצעות אזמלים סטריליים נשלפים. לאחר מכן, חתכו את החדר השמאלי לגושים של 1-2 ס"מ³ כל אחד באמצעות סכיני גילוח. השתמש בחתיכה אחת לחיתוך ושמור את החתיכות הנותרות בצינור 50 מ"ל בתמיסה קרה של טירודה על קרח לחיתוך מאוחר יותר, במידת הצורך.
   הערה: לעסות את הרקמה לפני חיתוך עם הידיים, במיוחד אם זה הבלוק השני. עיסוי מסייע לשחזר את תצורת סיבי השריר הנכונה ומונע כל נוקשות בתוך בלוק הלב.
4. מוסיפים 1-2 טיפות דבק רקמות (טבלת חומרים) למחזיק דגימת המתכת ומדביקים חתיכה מגוש אגר 4% בשטח פנים של כ-1 ס"מ².
5. מוסיפים 1-2 טיפות דבק רקמות על האגר.
6. הדביקו את בלוק הלב לאגר כאשר צד אפיקרדיום הלב פונה כלפי מטה על דבק הרקמה וודאו שהוא שטוח ככל האפשר. לאחר מכן, להעביר את בעל הרקמה עם בלוק הלב למקומו באמבט חיתוך של ויברטום.
7. חברו את צינור החמצן לאמבט החיתוך ואת מגש המתכת המלא בתמיסה של Tyrode לאיסוף הפרוסות (אמבט Tyrode מחומצן). לאחר מכן, הוסף מסננות תאים 40 מיקרומטר במגש המתכת כדי לאסוף את הפרוסות לאחר החיתוך.
8. התאמת מיקום הפריסה
   1. באמצעות תוכנת ההפעלה vibratome ולוח המחוונים, כוונן את גובה הלהב/הדגימה. בחר בלחצן הגובה ופעל בהתאם להוראות שעל המסך לכוונון הגובה. באופן אידיאלי, החזיקו את הלהב קרוב לחלק העליון של הרקמה אך מתחת לשרירים הפפילריים וודאו שיש נוזל המכסה את הרקמה ואת הלהב לפני החיתוך.
   2. התאם היכן להתחיל לחתוך את הרקמה על ידי בחירה בלחצן ההתקדמות. לחץ על כפתור הפרוסה והגבר את המהירות באמצעות הידית כדי להזיז את הלהב לכיוון קצה הרקמה. לאחר מכן, לחץ שוב על פרוסה כדי לעצור ולחץ על לחצן ההתקדמות כדי להשבית את התהליך.
   3. התאם את פרמטרי החיתוך: מהירות מתקדמת = 0.03 מ"מ לשנייה, תדר רטט = 80 הרץ, ומשרעת רטט אופקית = 2 מ"מ. לאחר מכן, התחל לפרוס על ידי בחירה בלחצן הפרוסה.
   4. תנו לוויברטום לחתוך עד שהוא מגיע לקצה הרקמה אך לפני שהוא פוגע בקצה האחורי של מחזיק הדגימה. בשלב זה, לחץ שוב על פרוסה כדי לעצור. הכה את Return כפתור כדי לחזור למצב ההתחלה.
   5. בחר חזרה אוטומטית (לחיצה עליו פעמיים) שתאפשר למיקרוטום הרוטט לחזור אוטומטית על תהליך החיתוך עד 99 פעמים.
9. איסוף פרוסות
   1. חכו עד שהפרוסות יהיו באורך מלא וייראו טוב (לאחר שעברו את שכבות שריר הפפילרי), ואז התחילו לאסוף את הפרוסות.
   2. אוספים את הפרוסות בעזרת פיפטת פסטר מפלסטיק מלאה בתמיסה קרה של טירודה כדי לתפוס בעדינות את הרקמה מהאמבטיה. במידת הצורך, השתמש במלקחיים ובמספריים קפיציים כדי לנתק את הפרוסה מבלוק הלב אם הרקמה עדיין מחוברת.
   3. מעבירים את הפרוסה למסננת תא אחד באמבט המחומצן של טיירוד (ראה שלב 1.7) ומשתמשים בנוזל בפיפטת פסטר מפלסטיק כדי לגרום לרקמה לשכב שטוחה על אחת ממסננות התא, ואז מוסיפים מכונת כביסה מתכתית בחלק העליון כדי להחזיק את הרקמה כלפי מטה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז	Bioline, ארצות הברית	ביו-41025
2,3-בוטנדיון מונוקסים (BDM)	פישר	AC150375000
סידן כלורי (CaCl2)	פישר	C79-500
להבים קרמיים למיקרוטום רוטט	קמפדן אינסטרומנטס	7550-1-ג
D-גלוקוז	פישר	ד16-1
אזמל חד פעמי #20	Biologyproducts.com	DS20X
מסננת תאי בז, סטרילית, קורנינג	VWR	21008-952
הפרין נתרן מלח	סיגמא-אולדריץ'	H3149-50KU
HEPES	פישר	BP310-1
היסטואקריל BLUE דבק רקמות	אמזון		https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/
איריס ספרינג מספריים	פישר	NC9019530
איריס מספריים ישרים	פישר	731210
מגנזיום כלורי (MgCl2)	פישר	M33-500
וסת חמצן	פרקסאייר
בלוני חמצן	פרקסאייר
פיפטות פסטר פלסטיק	פישר	13-711-48
אשלגן כלורי (KCl)	פישר	AC193780010
להבי מלבן תער	פישר	12-640
אזמלים נשלפים	פישר	22-079-716
סודיום ביקרבונט (NaHCO3)	פישר	AC217125000
נתרן כלורי (NaCl)	פישר	AC327300010
מיקרוטום רוטט	קמפדן אינסטרומנטס	7000 SMZ-2