בידוד תרכובת ביציות קומולוס חזיריות: טכניקה לבידוד קומפלקס ביציות קומולוס מזקיק שחלות חזירי להפריה חוץ גופית

תקציר

מקור: Gorczyca, G. et al., Proteolytically Degradated Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Ovcyte Encapsulation. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מתאר את הטכניקה לבידוד קומפלקס קומולוס-ביציות או COC משחלות חזיריות. ניתן להשתמש ב- COC המבודד והשלם לביצוע הפריה חוץ גופית - טכניקת הרבייה בסיוע לפיתוח טיפולי פוריות.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בידוד של קומולוס-ביציות חזיריות

1. כדי לאסוף חומר לבידוד זקיקי השחלות, הבלו שחלות חזיריות מזימים לפני גיל ההתבגרות המינית (כ 6-7 חודשים, במשקל 70 עד 80 ק"ג) בבית מטבחיים מקומי. בחר כ -20 שחלות חזיר מ -10 בעלי חיים לבידוד קומולוס-ביציות (COC) בכל ניסוי.
   הערה: בהנחה שכל שחלה מניבה 3-5 זקיקים, מספר הזקיקים הכולל נע בין 60 ל-100.
2. מניחים את השחלות בתרמוס עם מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS; pH 7.4; 38°C) המכיל 1% תמיסה אנטי-מיקוטית (AAS). ודא כי החומר הניסיוני מועבר למעבדה בתוך 1 שעות, שם הוא נשטף פעמיים עם PBS סטרילי המכיל אנטיביוטיקה.
3. לאחר שטיפת השחלות, העבירו אותן לכוס המלאה במדיום טיפול (HM) (טבלת חומרים) ואחסנו אותן באינקובטור בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס למשך כל המניפולציות.
   הערה: לקבלת תוצאות מיטביות במהלך הטיפול בביציות, בצע את כל ההליכים במדיום DMEM/F12 (מדיום טיפול, HM) בתוספת של 2.5% אנטיביוטיקה/AAS וסרום בקר עוברי 10% (FBS) ובקר ב- pH ברמת CO₂ בסביבה, על שולחן חימום עם בקרת טמפרטורה (38 ° C) ומתחת למכסה המנוע של זרימה למינרית כדי למזער זיהום חיידקי
.
4. מזקיקים חזיריים גדולים (בקוטר 6-8 מ"מ) לאסוף נוזל פוליקולרי (FF) על ידי שאיפה וצנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לסנן את supernatant באמצעות מזרק סטרילי מחובר 0.2 מיקרומטר מסנני נקבוביות קרום להקפיא ב -80 ° C.
   הערה: השתמש מזרק אינסולין (u- 40) עבור שאיפת נוזל פוליקולרי.
5. ודא שרק זקיקים בריאים בגודל בינוני (בקוטר 4-6 מ"מ) נבחרים לבידוד COC.
   הערה: COCs של כיתה I, בעל ביצית שלמה ועגולה עם ooplasm הומוגני ו רב שכבתי (לפחות 3-4) קומולוס קומפקטי נחשבים מתאימים להליך IVM 3D נוסף.
6. כדי לבודד COC, להעביר 2-3 שחלות לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 10 ס"מ מלאה HM. בודד COC מזקיקים בינוניים על ידי ביצוע אחד ההליכים הבאים.
   1. חותכים בעדינות את פני השטח של זקיקי השחלות הבולטים עם להב כירורגי סטרילי 15C. זה יגרום לנוזל הזקיקים יחד עם COC לזרום החוצה לתוך צלחת פטרי.
   2. יש לשאוף את תכולת הזקיקים באמצעות מחט 28 גרם בגודל 5/8 אינץ' המחוברת למזרק חד פעמי ולהעביר אותה לצלחת פטרי.
      הערה: השליכו את שרידי רקמת השחלה. שלבי הבידוד הבאים מתבצעים תחת סטריאומיקרוסקופ.
7. הכינו 3-5 צלחות פטרי IVF בקוטר 60 מ"מ.
   1. הוסף 1 מ"ל של HM לבארות המרכזיות ושים 3-4 טיפות של HM (50 μL לכל טיפה) בטבעות החיצוניות שלהם.
   2. לאחר מכן, באמצעות מיקרופיפטה מפוליקרבונט, העבירו את ה-COC שלא ניזוקו לטיפות של HM בטבעות החיצוניות כדי לשטוף אותן לזמן קצר במשך 3-4 פעמים.
   3. בסוף, להעביר אותם בנפרד לתוך הבאר המרכזית. אחסנו את צלחות ההפריה החוץ גופית הללו באינקובטור להליכים נוספים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כללי
אנטיביוטיקה אנטיביוטית (100x) 100ml	תרמו פישר	15240062	2.5% ריכוז סופי לטיפול בינוני. 1% ב-PBS (שלב 1.2)
DMEM/F12 (500 מ"ל)	סיגמא-אולדריץ'	D8062	טיפול בינוני
FCS (100 מ"ל)	תרמו פישר	16140063	10% ריכוז סופי לטיפול בינוני. (שלב: 1.5)
PBS (1x, pH 7.4) 500 מ"ל	תרמו פישר	10010023
מדיום התבגרות
hCG (בקבוקון אחד של 10,000 U)	סיגמא-אולדריץ'	CG10
PMSG	BioVendor	RP1782721000
מכשירים ספציפיים, כלים
צלחת פטרי 30 מ"מ	TPP	93040
צלחת פטרי IVF 60 מ"מ	בז	353653
אינקובטור	פנסוניק	MCO-170AIC-PE	ניתן להשתמש במותגים אחרים
צלחת פטרי סטרילית (10 ס"מ)	NEST ביוטכנולוגיה	704002
תרמוס	קצ\'ואה	5602589	ניתן להשתמש במותגים אחרים