$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. אנקפסולציה במיקרוביוריאקטורים סופר-הידרופוביים של אתילן פרופילן מופלר (FEP).
הערה: ודא שכל הליכי ההבשלה במבחנה (IVM) מתבצעים על שולחן מבוקר תרמוסטטית, וקומפלקסים של קומולוס-ביציות (COC) נשמרים בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס לאורך כל הטיפול בהם.
- הכינו צלחת פטרי בקוטר 30 מ"מ המכילה 5 גרם אבקת FEP בגודל חלקיקים ממוצע של 1 מיקרומטר<בר/>
הערה: חשוב להשתמש באבקת FEP טרייה. FEP בשימוש חוזר נוטה להצטבר וליצור גושים.
- יש לפזר טיפה אחת של מדיום התבגרות (MM) (~ 30 μL בנפח) המכילה 3-5 COC על מצע אבקת FEP. סובבו את הצלחת בעדינות בתנועה סיבובית כדי לוודא שחלקיקים אלה כיסו לחלוטין את פני השטח של טיפת הנוזל ונוצרו גולות נוזליות (LM).
- להרים LM שנוצר באמצעות פיפטה עם 1,000 μL tip.
הערה: חתכו את קצה הפיפטה בקצה כדי להתאים אותו לקוטר ה-LM (4-5 מ"מ). הקוטר המשוער של טיפ מוכן כזה צריך להיות מעט גדול יותר מזה של LM.
- הכינו מספר צלחות פטרי של הפריה חוץ גופית (IVF) בקוטר 60 מ"מ. הוסיפו 3-4 מ"ל מים סטריליים לטבעות החיצוניות כדי להכין את תא הלחות. לאחר מכן, מקם LM אחד לתוך הבאר המרכזית.
הערה: הליך זה דורש מיומנויות ידניות טובות ודיוק - אם השיש ממוקם ברשלנות או נופל אפילו מגובה נמוך, הוא ייהרס.
- לדגור על גולות במשך 4 ימים ב 38 ° C באינקובטור 5% CO2.
- שנה את המדיום מדי יום לאחר ההליך: החל 30 μL של MM על כל LM, אשר יגרום להתפשטותם מכיוון שמגע נוזלי ישיר משבש את ההידרופוביות של אבקות FEP מצופות. כאשר תכולת השיש מתמוססת, מעבירים COC המשתחררים מהביוריאקטור לטיפת MM טרי בצלחת פטרי.
הערה: כדי להעביר במדויק COC משוחרר, השתמש מיקרופיפטה פוליקרבונט.
- לאחר מספר שטיפות ב-MM (3-4 פעמים) כדי להסיר חלקיקי FEP, העבירו אותם עם 30 μL של MM טרי על מצע אבקת FEP. סובבו בעדינות את הצלחת בתנועה סיבובית כדי להבטיח שחלקיקי האבקה יכסו לחלוטין את פני השטח של טיפת הנוזל וייצרו LM חדש.
- להרים LM שנוצר באמצעות פיפטה עם קצה 1,000 μL.
- הוסיפו 3-4 מ"ל מים סטריליים לטבעות החיצוניות כדי להכין את תא הלחות. לאחר מכן, הכניסו LM אחד לבאר המרכזית של צלחת פטרי IVF.
הערה: הציפוי השקוף של אבקת FEP מאפשר לנטר תוכן LM באמצעות מיקרוסקופ אור.