אבלציה סלקטיבית בסיוע לייזר של תאי אנדותל בקרנית חזיר: טכניקה לגרימת פגיעה ממוקדת באנדותל הקרנית עבור מחקרי Ex Vivo

תקציר

מקור: Holzhey, A. et al., פיתוח מודל ניסיוני לא פולשני, בסיוע לייזר של אובדן תאי אנדותל בקרנית. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים הליך לא פולשני בסיוע לייזר לפגיעה סלקטיבית בתאי האנדותל של הקרנית בעין החזירית. מודל ex vivo שפותח של נזק לתאי אנדותל יכול לשמש לחקר מחלות של אנדותל הקרנית.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת תרבית איברים וטיפול בלייזר

1. השג עיני חזיר טריות מבית המטבחיים המקומי. שמור אותם קרירים (4 ° C) בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם גלוקוז גבוה, בתוספת L-גלוטמין, נתרן פירובט, פניצילין/סטרפטומיצין (1%) וסרום חזירי (10%), ולכן ייקרא במאמר זה מדיום מלא.
2. הסר רקמות חוץ-תאיות עם מספריים והשרה את העיניים בתמיסת עיניים 5% פובידון-יוד למשך 5 דקות לפני הנחתן במי מלח מעוקרים חוצצי פוספט (PBS) עד לשימוש.
3. עיני מסך לפתולוגיות עיקריות של סגמנט קדמי, כגון צלקות בקרנית, בצקת ואטימות אחרת עם מכשיר טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית בתחום הספקטרלי (טבלה של חומרים).
4. מקם את העיניים מול יחידת מנורת סדק המצוידת בלייזר Nd:YAG (טבלת חומרים), בעל אורך גל של 1,064 ננומטר וקוטר מוקד של 10 מיקרומטר באוויר.
   הערה: למיקום אופטימלי נעשה שימוש במתקן אחיזה מודפס בתלת-ממד, שתוכנן להחזיק את העין יציבה, מבלי להפעיל עליה לחץ רב מדי (איור 1).
5. השתמש בהגדלה של 12x והסט את התאורה כדי לדמיין את שכבות הקרנית הבודדות.
6. הגדר את אנרגיית הדופק (למשל, 1.6 mJ) ואת נקודת המיקוד (למשל, 0.16 מ"מ) עבור אבלציה סלקטיבית של תאי אנדותל.
7. מניחים פרסנטזיס קרנית שקוף קרוב ללימבוס ומזריקים ויסקו-אלסטי (טבלת חומרים) כדי לייצב את החדר הקדמי.
8. הבלו את הקרנית המרכזית שטופלה בלייזר באמצעות טרפין 8 מ"מ.
9. מניחים את הקרנית שנכרתה בבאר של צלחת בת 12 בארות כאשר אתר האנדותל פונה כלפי מעלה ודגרים על הדגימה ב -3 מ"ל של מדיום מלא ב 37 ° C למשך עד 3 ימים.
   הערה: ניתן להוסיף חומרים cytoprotective פוטנציאליים למדיום במהלך שלב זה.

תוצאות

איור 1: מערך ניסויי.(A) העיניים היו מקובעות במתקן אחיזה מודפס חלקית בתלת-ממד, שאיפשר יישור מדויק ביחס לקרן הלייזר. (B) לפני הטיפול בלייזר, הרקמה הוערכה באמצעות מכשיר טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית של מקטע קדמי כדי לבדוק פתולוגיות עיקריות של מקטע קדמי. מיקומים של נקודות לייזר מוקדיות מסומנים עם דוגמה עבור 0.0 מ"מ (כוכבית שחורה), 0.1 מ"מ (כוכבית אדומה) ו 0.2 מ"מ (כוכבית כ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ברון ואקום טרפין	קטנה	K20-2058
קריוסטט	לייקה	ס"מ 3050S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - גלוקוז גבוה	הרשות הפלסטינית	E-15009
מחזיק עיניים	עצמית	לא ישים
מיקרוסקופ הפוך	לייקה	DMI 6000 B
KH2PO4	מרק	529568
Na2HPO4	מרק	1065860500
Nd:YAG לייזר	Zeiss Meditec	VISULAS YAG II PLUS
OCT Tissue Tek	סאקורה פינטכניק	4583
פניצילין-סטרפטומיצין	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 4333
מלח חוצץ פוספט (PBS)	גיבקו	10010056
סרום חזיר	סיגמא-אולדריץ'	12736ג
טומוגרף קוהרנטיות אופטית בתחום הספקטרלי	היידלברג הנדסה	ספקטרליס
צלחת תרבית רקמה 12-באר	זארשטדט	833921
ויסקו-אלסטי	אומניויז'ן	מת'וסל