ביצוע הזרקה לחלק המישוש של בלוטת הדמעות העליונה: טכניקה לגרימת מחלת עין יבשה במודל ארנב

תקציר

מקור: Honkanen, R. A., et al. מודל ארנב של מחלת עין יבשה חסרת מים הנגרמת על ידי Concanavalin זריקה לבלוטות הדמעות: יישום למחקרי יעילות תרופות. J. Vis. Exp. (2020).

בסרטון זה, אנו מראים הליך לגרימת מחלת עין יבשה חסרת מים במודל ארנב על ידי הזרקת החלק המישושי של בלוטת הדמעות העליונה עם Concanavalin A. מודל זה שימושי עבור בדיקות פרמקוקינטיות והפצה ביולוגית של תרופות לטיפול במחלת עין יבשה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בעלי חיים ודיור

1. רכשו ארנבים לבנים מניו זילנד (NZW) במשקל 2-3 ק"ג.
2. אכסנו את הארנבים ביחידות בכלובים עם שליטה קפדנית בטמפרטורה (65 ± 5 מעלות פרנהייט) ובלחות (45 ± 5%). התאורה צריכה להיות מחזור הדלקה / כיבוי של 12 שעות.
3. החדר מספק גישה בלתי מוגבלת למים ולצ'או ארנבים סטנדרטי. הימנע העשרה תזונתיים כפי שהם עשויים להכיל ויטמין A המשפיע על העין.
4. התאקלמו אצל בעלי החיים לפחות שבועיים לפני מדידות בסיסיות או השראת עין יבשה.

2. שיטות הרדמה והמתת חסד

הערה: כל ההליכים דורשים טשטוש קל למעט זריקת Con A הדורשת טשטוש מתון.

1. להרגעה קלה, יש להזריק אצפרומזין (1 מ"ג/ק"ג) תת עורית על הכתפיים באמצעות מחט באורך 26 מד. נקודת קצה להרגעה קלה: בעלי חיים שומרים על תנוחת ראש רגועה עם אונות אוזניים שכבר אינן זקופות לחלוטין.
   הערה: אם לא מגיעים לנקודת הקצה המתאימה, ניתן לתת זריקה נוספת של אצפרומזין. בעלי חיים צריכים תמיד להישאר ערים, מגיבים למגע בשפמם, ולעולם לא להראות נשימה איטית.
2. עבור הרגעה מתונה, תחילה לתת את החיות acepromazine כאמור לעיל. לאחר שמגיעים לנקודת הסיום (ראו הערה למעלה), תנו איזופלורן באמצעות מסיכת גז עם זרימת O₂ מוגדרת ל-1 ליטר/דקה והעברת איזופלורן מוגדרת ל-5% (איור 1).
3. יש לתת איזופלורן עד שטונוס הגוף של הארנב רגוע לחלוטין והאוזניים רפויות לחלוטין.
   הערה: אין לבצע תנועות שרירים מפצות כאשר החיה פונה על צדה; הנשימה תמיד נשארת ספונטנית.
4. התאוששות ספונטנית מתרחשת תוך 2-5 דקות: הסימנים כוללים תנועות ראש ספונטניות וטונוס שרירים מוגבר או נורמלי. לאחר השלמת הליך הניסוי עם הרגעה מתונה, להתבונן בארנבים במשך כ -30 דקות או עד שהתנהגותם חוזרת לנורמה.
   הערה: משחה אופתלמית אינה נדרשת במהלך אף אחת מצורות ההרגעה. 1) בטשטוש קל, בעלי החיים עדיין ערניים ושומרים על רפלקס מצמוץ. בהרגעה מתונה, עיכוב רפלקס המצמוץ הוא כה קצר עד כי משטח העין אינו נמצא בסיכון. 2) מיקום משחת עיניים על פני העין מונע הדמיה של מבנים המוערכים במהלך הבדיקה.
5. המתת חסד: השתמש מנת יתר של pentobarbital תוך ורידי (100 מ"ג / ק"ג).

3. אינדוקציה וטיפול בעין יבשה

הערה: שלושה חלקים של מערכת בלוטת הדמעות המסלולית מוזרקים.

1. להרגיע את הארנבות עם acepromazine 0.2 מ"ג / ק"ג תת עורית.
2. יש לגזור את הפרווה באזור הפריאורביטלי והקרקפת ולהסיר לחלוטין כל שאריות פרווה באמצעות Nair. השאירו את העור חלק לחלוטין להדמיה טובה יותר של סימני ההיכר האנטומיים והזרקה מונחית ארה"ב של concanavalin A (איור 2).
3. יש לגרום להרגעה מתונה כמתואר לעיל.
4. הזרקת החלק המישושי של בלוטת הדמעות העליונה (PSLG)
   הערה: בצע תחילה הזרקה של PSLG.
   1. יש למרוח על העין המתאימה 25 μL של לידוקאין 1% ללא חומרים משמרים עם מיקרופיפטה.
   2. יש לסובב את העפעף העליון ולהפעיל לחץ מדיאלי עדין על השפה האורביטלית האחורית עד להופעת הבליטה המסמנת את החלק המישושי של הבלוטה. PSLG מופיע כהגבהה בולבוסית קטנה בחלק האחורי (הרקתי) של העפעף העליון.
      הערה: כדי לראות את רקמת הבלוטה במהלך תהליך הלמידה, מרחו 5% פלואורסצאין על האזור (איור 3A). ניתן לראות דמעות זולגות מה-PSLG הבולבוסי. יישום של fluorescein אינו נחוץ לניהול Con A; זה נעשה רק למטרות המחשה כדי להראות את רקמת הבלוטה.
   3. באמצעות מלקחיים עדינים ומחט 27 מד על מזרק שחפת, לחדור ישירות את הבלוטה באמצעות גישה transconjunctival. מקדמים את המחט 2 מ"מ לתוך הרקמה ומזריקים 500 מיקרוגרם של Con A בנפח של 0.1 מ"ל (איור 3B).
      הערה: זריקה זו יכולה לפעמים להיות כואבת. במידת הצורך, שמור את בעלי החיים תחת isoflurane עד הזרקה זו הושלמה.

תוצאות

איור 1: הרגעה של מסכות גז. בתצלום זה נראית מסכת הגז המספקת הרגעה מתונה קצרה עם איזופלורן.

איור 2: הכנת ארנב לזריקות concanavalin A. (A) גזירים קטנים משמשים להסרת פרווה, מה שמאפשר הדמיה קלה יותר של ציוני דרך כדי לזהות את בלוטת הדמעות הע...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
27 מחטי מד (5/8)	בקטון דיקינסון ושות', פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי	305921	מחטים להזרקת ConA לבלוטות הדמעות
Aceproinj (acepromazine)	Henry Schein Animal Health, דבלין, אוהיו	NDC11695-0079-8	0.1 מ"ל/ק"ג הזרקה תת עורית להרגעת ארנב
וופורייזר הרדמה	VetEquip , פלזנטון, קליפורניה	פריט #911103
הבישוף הרמון מלקחיים	באוש ולומב (סטורץ), ברידג'ווטר, ניו ג'רזי	E1500-C	מלקחיים רקמה
Concanavalin A	Sigma , סנט לואיס, מיזורי	C2010	הכינו 5 מ"ג/מ"ל ב-PBS להזרקה לבלוטות דמעות ארנב
פלואורסצאין	אקרון, לייק פורסט, אילינוי	NDC17478-253	לדלל ל 0.2% עם PBS כדי למדוד TBUT
איזופלורן	הנרי שיין, מלוויל, ניו יורק	29405
לידוקאין	Sigma , סנט לואיס, מיזורי	L5647	1% ב- PBS לחומר הרדמה
PBS (מלח חוצץ פוספט)	Mediatech, Inc. מנסאס, וירג'יניה	21-031-CV
ארנב, ניו זילנד חגורה לבנה או הולנדית (כמתואר בטקסט)	מעבדות נהר צ'ארלס, וולת'הם, מסצ'וסטס	2-3 ק"ג	חיות מחקר
זכוכית מגדלת כירורגית +1.50	עיצובים עבור חזון, בוהמיה, ניו יורק	פריט מיוחד	לספק הגדלה של פני העין תוך התבוננות בפירוק דמעות וביצוע זריקות Concanavalin A.