כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. בידוד של תאי אנדותל אבי העורקים חזירי
- בתנאים אספטיים, הסירו את אבי העורקים של החזיר ממאגר הכביסה, והניחו אותו על צלחת פטרי בקוטר 150 מ"מ (איור 1A).
- חתכו בעדינות את שני הקצוות של אבי העורקים והוציאו שוב את עודפי הרקמה סביב אבי העורקים בעזרת מלקחיים סטריליים ומספריים (איור 1B). שטפו את החלק החיצוני והפנימי של אבי העורקים (מעל צלחת התרבית בטמפרטורת החדר) עם 20-50 מ"ל של חיץ כביסה: 1x תמיסת PBS (pH 7.4) עם 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין.
הערה: נסו לחתוך רק את האזור שבו הונחו המלחציים במהלך הניתוח מכיוון שחלק מה- ECs נפגעו באזור זה, ולהסיר רקמות עודפות וענפי צד עורקיים.
- מעבירים תפר כירורגי דרך אבי העורקים ולאחר מכן קושרים קצה אחד של אבי העורקים באמצעות התפר הכירורגי (5-0, 90 ס"מ, טבלת חומרים). שמור את התפר הניתוחי בחלק הפנימי של אבי העורקים (איור 1C,D).
- מקמו בעדינות את אבי העורקים ליד הקצה הקשור בעזרת מלקחיים, ואז משכו את התפר הכירורגי באיטיות כדי להפוך את אבי העורקים עד שמשטח האנדותל של אבי העורקים נחשף (איור 1E−G).
הערה: הקפידו לקבע את אבי העורקים בסמוך לקצה הקשור ואל תקנו את אבי העורקים בחוזקה, אחרת לא ניתן להפוך את אבי העורקים על ידי משיכת התפר הניתוחי.
- לשטוף את משטח האנדותל של אבי העורקים עם חיץ כביסה 3x (10 מ"ל לכל כביסה), ולאחר מכן להשליך פתרון זה. הכניסו את אבי העורקים לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל, וכסו את אבי העורקים ב-10 מ"ל של תמיסת עיכול מסוג 0.005% collagenase IV בצינור (איור 1H).
הערה: חממו מראש את תמיסת העיכול 0.005% collagenase IV ב-37°C לפני העיכול.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות. הכניסו את אבי העורקים המעוכל ותמיסת העיכול לתבנית תרבית בקוטר 100 מ"מ ועצרו את ההשפעות של 0.005% collagenase IV על ידי הוספת 10-15 מ"ל של חיץ עצירה מקורר מראש: מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS מנוטרל חום ו-1% P/S.
הערה: זמן העיכול המומלץ הוא בין 10 ל -20 דקות. ודא שמשטח האנדותל של אבי העורקים מכוסה על ידי חיץ העצירה.
- גרדו בעדינות pAECs מהמשטח הפנימי של אבי העורקים באמצעות מגרד תאים (איור 1I). שטפו את אבי העורקים המגרד 3x עם חיץ כביסה (5 מ"ל בכל פעם). הכניסו את התמיסה מצלחת התרבית לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. שטפו את תחתית צלחת התרבית 2x עם חיץ כביסה (5 מ"ל בכל פעם), והכניסו את התמיסה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל שוב.
הערה: מגרדים בכיוון אחד בעדינות ולא דוחסים. אין לגעת ברקמה ליד הקצוות והחורים. מומלץ לגרד 5-8x.
- צנטריפוגה את הצינור ב 600 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant ולהשאיר 10 מ"ל של תמיסה בתחתית צינור צנטריפוגה 50 מ"ל. הוסף 20 מ"ל של חיץ כביסה לצינור הצנטריפוגה 50 מ"ל והשהה מחדש את הכדורים. הימנע מבועות במהלך שלב זה.
- צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C. להשליך לאט את supernatant. להשעות מחדש את כדורי התא עם 1 מ"ל של מדיום תרבית ולערבב היטב.
הערה: המספר הממוצע המתקבל של ECs לכל אבי עורקים ס"מ הוא 1.9 x 10⁵ ± 1.4 x 10⁴ (ממוצע ± SD, n = 3).
- ספירת התאים באמצעות מונה תאים. מקציפים ומקציפים את התאים בכלי ללא ציפוי חומרים כלשהם בהתאם למספר התא. אם מספר התא קטן או שווה ל- 1.0 x 10⁶, תרבית תאים בבקבוק בגודל 25 סמ"ר. אם מספר התא גדול מ- 1.0 x 10⁶, תרבית תאים בכמה צלוחיות בגודל 25 סמ"ר (1.0 x 10⁶ תאים לכל צלוחיות). מניחים את הבקבוק באינקובטור (ללא טלטול) בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ ומחליפים את המדיום כל 2-3 ימים.
הערה: חלק מהתאים ניזוקים על ידי מגרד התא. בדיקת כדאיות התא מצאה שאחוז התאים החיים הוא 95.7% ± 1.7% (ממוצע ± SD, n = 3). זמן ההכפלה של התאים המבודדים הוא כ-1-2 ימים.
