$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. בידוד עורקים ריסניים אחוריים קצרים
עיניים חזיריות יחד עם עצב הראייה ורקמות חוץ-עיניות התקבלו מיד לאחר המוות. עיניים מלומדות הועברו למעבדה במי מלח חוצצים פוספט קר כקרח (PBS) ונעשה בהם שימוש מיידי.
הערה: העין הגבית מחולקת באופן בסיסי לחלק הקדמי (איור 1A) והאחורי (איור 1B).
- הניחו את גלובוס העין בתא דיסקציה המכיל חיץ קרבס-הנסלייט (K-H) קר כקרח. חתכו בזהירות את השרירים והרקמות שמסביב בעזרת זוג מספריים חדים של מאיו.
הערה: כדי להכין חיץ קרבס-הנסלייט (K-H), שקול את הכימיקלים הבאים (27.68 גרם NaCl, 8.4 גרם NaHCO 3,1.4 גרם KCl, 1.18 גרם של MgSO4 ו- 0.64 גרם של KH2PO4) לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי יבש ונקי אחד של 50 מ"ל ו- 1.47 גרם של CaCl2 ו- 8.0 גרם גלוקוז לתוך צינור אחר. תערובת האבקה של כימיקלים אלה צריכה להיות מאוחסנת במקום קריר ויבש. תערובת CaCl2 ואבקת גלוקוז מוכנה בצורה הטובה ביותר טרייה כדי למנוע ספיגת לחות וגבשים.
- בצע חתך עם אזמל ולחתוך את הגלובוס לאורך המישור המשווני עם זוג מספריים חדים מאיו עד העין מופרדת לחצי הקדמי והאחורי. הסר גוף זגוגי רב ככל האפשר מהחצי האחורי של העין באמצעות זוג מלקחיים סטנדרטיים.
הערה: הפרדת גלובוס העין לשני חצאים מאפשרת בידוד של עורקים ריסניים אחוריים קצרים (sPCA) בקלות ללא עין זזה בצלחת. עם זאת, צעד זה אינו חובה. ניתן גם לבודד את כלי הדם מבלי לפתוח את גלובוס העין.
- השתמש בסיכות דיסקציה כדי להצמיד בזהירות את החצי האחורי של העין כאשר צד הרשתית כלפי מטה ועצב הראייה פונה כלפי מעלה לכיוון הנסיין.
- חתכו בעדינות את רקמות החיבור המקיפות את עצב הראייה כדי לחשוף את כלי הדם הרטרובולבריים הבסיסיים בעזרת זוג מספריים קפיציים של Student Vannas.
- ניתן לראות את ה-sPCA כענפים קצרים של כלי דם (בין 5-8 ענפים) החודרים את לובן העין ומקיפים את ראש עצב הראייה (איור 1C). בודדו את ה-sPCA הפראופטי והדיסטלי יחד עם רקמות החיבור שמסביב בעזרת זוג פינצטות מדויקות מסוג 5 ומספריים של Vannas capsulotomy (איור 1D).
הערה: ודא כי חיץ K-H נשאר קר כקרח לאורך כל הליך הבידוד. מומלץ מאוד להחליף את החיץ כל 20-30 דקות, בהתאם לטמפרטורת הסביבה.
2. הכנת דוגמאות
- הסר בעדינות רקמות חיבור ממקטעי העורקים באמצעות פינצטה מדויקת במיוחד מסוג 5 ומספריים של Vannas capsulotomy תחת סטריאומיקרוסקופ ושטוף את העורקים המבודדים ב- PBS קר כקרח כדי להסיר מזהמים ושאריות דם.
הערה: אם הדגימות אינן חשופות לשלבים הבאים באופן מיידי, יש להקפיא אותן בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
