ויטריפיקציה של עוברי ארנב באמצעות קש קריוגני: טכניקת קירור מהירה במיוחד לשימור עוברי ארנבים לאחסון לטווח ארוך

תקציר

מקור: Garcia-Dominguez, X. et al. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Phase in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מתארים את הליך הוויטריפיקציה של עוברי ארנבים שנקטפו בשלב ההתפתחות הרצוי באמצעות אתילן גליקול ודימתיל סולפוקסיד כהגנה קריוגנית וקש קריוגני כמערכת הנשא. לעוברים המזוגגים יש שיעור הישרדות גבוה וניתן לאחסן אותם לתקופה ממושכת עד לשימוש.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הביקורת הווטרינרית JoVE.

1. ויטריפיקציה של העובר

1. בצע את כל המניפולציות בטמפרטורת החדר (סביב 22 °C) כדי להפחית את רעילות תמיסת הוויטריפיקציה בטמפרטורות חמות יותר.
   הערה: ניתן להעביר עוברים באמצעות פיפטה אוטומטית 0.1-2 μL בפרוטוקול זה, אך מכשירים דומים אחרים להזזת העוברים הגוררים את הנפח המינימלי יכולים להתאים.
2. ויטריפיקציה של העוברים בהליך הוספה בן שני שלבים:
   1. הניחו את העוברים למשך 2 דקות בתמיסה מאוזנת המורכבת מ-10% אתילן גליקול ו-10% (v/v) דימתיל סולפוקסיד מומס בתווך בסיס (BM). (הרכב BM: מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) בתוספת 0.2% (w/v) של אלבומין בסרום בקר)
   2. העבירו את העוברים (משלב 1.2.1) למשך דקה אחת לתמיסת ויטריפיקציה המורכבת מ-20% אתילן גליקול ו-20% (v/v) דימתיל סולפוקסיד מומס ב-BM.
3. העמיסו את העוברים לתוך מיניקש פלסטיק בנפח 0.25 מ"ל (המכיל קצה סגור אחד עם תקע כותנה וקצה אחד פתוח). התהליך מסוכמת באיור 1.
   1. חבר את הקצה הסגור של מיניסטרו 0.25 מ"ל עם המיקרו-דיספנסר המתאים (למשל Captroll III).®
   2. שואפים BM עד 1/3 מאורך הקש, ולאחר מכן בועת אוויר קטנה.
   3. שאפו את העוברים בנפח של 40 מיקרוליטר של תמיסת ויטריפיקציה, ואחריה בועת אוויר קטנה נוספת.
   4. שאפו BM עד שהחלק הנוזלי הראשון (שלב 1.3.2) יגיע לכותנה.
   5. סגור את הקצה הפתוח באמצעות תקע קש.
4. בצע את שלב 1.2.2 בזמן ששלב 1.3 נעשה כדי להבטיח שלא תעבור יותר מדקה, דבר שיהיה רעיל לעוברים.
5. טבלו את המיני-קש ישירות בחנקן נוזלי כדי להשיג ויטריפיקציה.
6. אחסנו את המיניקש בדיואר לחנקן למשך הזמן הרצוי.

תוצאות

איור 1: סכמטיזציה של קש טעון כראוי. א) BM מתייחס לעובר העושה מניפולציה במדיה המופעלת במהלך ויטריפיקציה. יש לטעון עוברים בתמיסת ויטריפיקציה. ב) מראה מקרוסקופי של הקש הטעון עם פירוט מוגדל של מיקום העובר. מכשיר בנפח גדול זה מאפשר לנו לזגוג מספר רב של עוברים, בניגוד למכשירי נפח מינימלי. יתר על כן, הטיפול במכשיר זה קל יותר בהשוואה להתקני נפח מינימלי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אלבומין בסרום בקר (BSA)	VWR	332
דימתיל סולפוקסיד	סיגמא אולדריץ'	W387509
מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS)	סיגמא אולדריץ'	D5773	ללא סידן כלורי.
אתילן גליקול	סיגמא אולדריץ'	102466-מ
חנקן נוזלי	נוזל אוויר	P1505XXX
קש פלסטיק 0.25 מ"ל	IMV - טכנולוגיות	6431
סטריאומיקרוסקופ	לייקה	MZ16F	ישנן אפשרויות זולות יותר כגון Leica MZ8 או Nikon SMZ-10 או SMZ-2B, בין היתר.
תקע קש	IMV - טכנולוגיות	6431