טעינת חרוזים להחדרת חומצות גרעין לתאים מתורבתים דבקים: טכניקה לטעינת פלסמידים מקודדי חלבון פלואורסצנטי לתאי יונקים דבקים

תקציר

מקור: Cialek, C. A. et al. טעינת חרוזים חלבונים וחומצות גרעין לתוך תאים אנושיים דבקים. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה אנו מתארים את ההליך להחדרת חומצות גרעין לתאי יונקים דבקים באמצעות העמסת חרוזים.

פרוטוקול

1. תאי טעינת חרוזים

הערה: במידת הצורך, שטפו את התאים לזמן קצר עם מלח חוצץ פוספט (PBS) ולאחר מכן הוסיפו 2 מ"ל של המדיום האופטימלי. יש לדגור במשך 30 דקות לפחות.

1. הכינו תמיסה של 3-8 מיקרוליטר המכילה את הפלסמידים הרצויים, חלבונים ו/או חלקיקים. יש להשתמש ב~1 מיקרוגרם (0.1-1 pmol) מכל סוג פלסמיד וב~0.5 מיקרוגרם (0.01 ננומול) חלבון, בהתאם לדרישות הניסוי. השתמש בצינור בעל שימור נמוך עבור חלבונים, כך שהם לא יישארו מאחור על דפנות הצינור. הביאו את התמיסה למינימום של 3 μL עם PBS, וכווננו את נפח התמיסה כך שיצפה את כל אזור התאים שיש לטעון (כלומר, המיקרו-באר של התא, איור 1B).
2. מערבבים היטב את התמיסה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה ו / או הזזת הצינור. סובבו בקצרה את התמיסה לתחתית הצינור במיקרופוגה שולחנית.
3. מעבירים את תמיסת העמסת החרוזים ואת תא התאים למכסה מנוע של תרבית רקמה. בצע את השלבים הנותרים במכסה המנוע של תרבית הרקמה בטכניקה סטרילית.
4. הסר את המדיום מהתאים ואחסן אותו באופן זמני בצינור סטרילי. שאפו בעדינות את כל המדיום מקצוות התא והטו את התא בזווית של כ-45° והוציאו את טיפת המדיה שנותרה במיקרו-באר המרכזית. במהלך הסרה בינונית, הקפידו להימנע מלתת לקצה הפיפטה לגעת בזכוכית, מה שעלול לגרום לקילוף התאים ולאיבוד. עבור במהירות לשלב הבא, כך שהתאים לא יתייבשו לאורך זמן.
5. מזרימים בעדינות את תמיסת העמסת החרוזים על מיקרווול הזכוכית במרכז החדר. אופציונלי: לדגור עם נדנוד עדין במשך ~30 שניות מבלי לאפשר לתא להתייבש לחלוטין.
6. פזרו בעדינות שכבה אחידה של חרוזי זכוכית על גבי התאים, רצוי באמצעות מנגנון העמסת חרוזים (איור 1A). ודא שהחרוזים מכסים לחלוטין את התאים במיקרו-באר שבתחתית הזכוכית.
7. צובט את החדר בשתי אצבעות, טפח אותו על משטח מכסה המנוע על ידי הרמת אותו ~ 2 אינץ 'והורדתו בחוזקה. השתמש בכוח שווה ערך בערך להפלת המנה מגובה זה. חזור על הפעולה עבור סכום כולל של ~10 הקשות.
   הערה: יש לוודא שהברזים אינם מקלפים באופן משמעותי את התאים. ניתן למטב את ההקשה עבור סוג התא. אם התאים נטענים בצורה גרועה, הקש חזק יותר; עם זאת, אם תאים רבים מתקלפים, הקש בעדינות רבה יותר.
8. הוסיפו בעדינות מדיום בחזרה לתא על ידי פיפטציה איטית על צד הפלסטיק של התא. נסו לשאוף כל חרוז צף מבלי להפריע לתאים. הוסף מדיה מחוממת מראש בשלב זה אם הוסר יותר מדי. לדגור על התאים במשך 0.5-2 שעות באינקובטור.

תוצאות

איור 1: מנגנון טעינת חרוזים, טכניקה וציר זמן

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כלי תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ	VWR	82050-916	שימוש לתרבית תאים
כלים 35 מ"מ לתרבית תאים	בז	353001	השתמש לבניית טוען חרוזים
תא Attofluor	תרמו פישר סיינטיפיק	A7816	השתמש בו כדי לבנות את טוען החרוזים המותאם אישית
DMEM, גלוקוז גבוה, ללא גלוטמין	תרמו פישר סיינטיפיק	11960069	שימוש בתרבית תאים כללית
כלי זכוכית תחתונים, 35 מ"מ, #1.5, 14 מ"מ זכוכית	תאגיד MatTek	P35G-1.5-14-C	תאי זרע על תאים אלה לצורך הדמיה
חרוזי זכוכית, שטופים בחומצה, ≤106 מיקרומטר	מיליפור סיגמא	G4649	מפזרים על התאים להעמסת חרוזים, פלסמיד, דנ"א וחלבונים
מלח חוצץ פוספט (PBS)	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9625	מלאי עבודה של 1X PBS סטרילי
DMEM ללא פנול	תרמו פישר סיינטיפיק	31053036	שימוש בתאים לפני הדמיה
Opti-MEM, סרום מופחת בינוני	תרמו פישר סיינטיפיק	31985070	מדיה אופטימלית לדגירת תאים לפני טעינת חרוזים (שלב אופציונלי)