משלוח מבוסס ננו-להבים של מטען חומצות גרעין: טכניקה להעברת קומפלקס Cas9-sgRNA לתאי מטרה באמצעות חלקיקים דמויי וירוסים

תקציר

מקור: Mangeot, P. E., et al. העברת קומפלקס Cas9/sgRNA ריבונוקלאו פרוטאין בתאים אימורטליים וראשוניים באמצעות חלקיקים דמויי וירוס ("ננו-להבים"). J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים טכניקה להעברה מבוססת ננו-להבים של קומפלקס Cas9-sgRNA ribonucleoprotein בתוך תאי מטרה לצורך עריכת גנום. ננו-להבים הם חלקיקים דמויי וירוס חסרי יכולת להתרבות ולהדביק תאים שכנים, ולכן הם שימושיים מאוד להובלה מהירה ותלויה במינון של ביו-חומרים וננו-חומרים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. sgRNA עיצוב ושיבוט

הערה: הנחיות לתכנון sgRNA ניתן לקבל ממקורות מרובים כגון https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing או מ- Hanna and Doench.

1. לאחר תכנון 20 רצפי sgRNA של נוקלאוטידים, סדרו את אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים של DNA הבאים:
   1. קדימה: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N מתאים למוקד המטרה ללא רצף המוטיב הסמוך לפרוטוספייסר (PAM)
   2. הפוך: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 3' (N מתאים להשלמה הפוכה של מוקד המטרה ללא רצף PAM)
      הערה: אין צורך בשינויים מיוחדים בעת הזמנת האוליגונוקלאוטידים (אין דרישה לפוספט 5').
2. הכלאה של שני אוליגונוקלאוטידים של DNA בצינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) של 0.2 מ"ל על ידי ערבוב 5 μL של חיץ חישול (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; pH 7.9 ב 25 ° C), 1 μL של כל אוליגונוקלאוטיד DNA (100 מיקרומטר תמיסת מלאי במים), ו 42 μL של מים.
3. בבלוק PCR, דגרו על דגימות ב-95°C למשך 15 שניות ולאחר מכן הורידו את הטמפרטורה ל-20°C עם רמפה של 0.5°C/s. יש לשמור בטמפרטורת החדר או לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
4. עיכול 10 מיקרוגרם של פלסמידים לביטוי BLADE או SUPERBLADE sgRNA עם 10 יחידות של אנזים הגבלת BsmBI-v2 למשך 3 שעות ב-55°C בנפח תגובה כולל של 50 μL.
   הערה: הווקטור המעוכל צריך לשחרר תוספת DNA של ~1.9 kb ומקטע DNA שני של ~3.3 kb.
5. טען את תגובת ההגבלה על ג'ל אגרוז 1% מוכתם ב- 5 מיקרוגרם/מ"ל אתידיום ברומיד (או כתם ג'ל DNA חלופי בטוח יותר).
   הערה: ללבוש ציוד הגנה מתאים בעת מניפולציה אתידיום ברומיד, אשר חשוד בגרימת פגמים גנטיים.
   1. על שולחן אולטרה סגול (UV) המוגדר באורך גל של 312 ננומטר (כדי למנוע נזק לדנ"א), חתכו את מקטע הדנ"א 3.3 קילובייט מהג'ל, והניחו אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
      הערה: לבש ציוד הגנה מתאים (כפפות ומשקפי הגנה UV) בעת מניפולציה של אתידיום ברומיד ועבודה על שולחן UV.
   2. חלץ DNA מהג'ל הפרוס המכיל את מקטע ה- DNA 3.3 KB באמצעות ערכת מיצוי ג'ל DNA ייעודית (ראה טבלת חומרים). כמת את כמות הדנ"א המטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
6. קשר את אוליגונוקלאוטידים של DNA היברידי קדימה ואחורה משלב 1.2 לשלב BsmB1 מעוכל ומטוהר בג'ל או וקטור SUPERBLADE משלב 1.5.2. לשם כך, הוסף 2 μL של T4 DNA ligase buffer, 50 ng של וקטור מטוהר ג'ל (משלב 1.5.2), 1 μL של אוליגונוקלאוטידים DNA היברידי (משלב 1.2), מים כדי להשלים את נפח ל 19 μL, ו 1 μL של T4 DNA ligase. לדגור על התגובה ב 25 ° C במשך 10 דקות.
   1. הפוך את מוצר הקשירה לחיידקים מתאימים (ראה טבלת חומרים). צלחת את החיידקים שעברו טרנספורמציה על צלחת אגר ampicillin Luria Bertani ודגור לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
   2. בחר מספר מושבות מבודדות על לוחית האגר כדי לבצע מיני-הכנה של DNA (ראה טבלת חומרים), ובצע ריצוף Sanger באמצעות פריימר קדמי U6 (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') כדי לבדוק קשירה נכונה של רצף משתנה sgRNA.
      הערה: ניתן להשתמש בפלסמידים אחרים של ביטוי sgRNA אם הם אינם מקודדים לחלבון Cas9, מה שעלול להפריע לייצור ננו-להבים.

2. הכנת פלסמיד

1. בצע maxipreparation (ראה טבלה של חומרים) של כל פלסמידים נדרשים, ולהכין 10 מיקרוגרם aliquots ב 1 מיקרוגרם / מ"ל לאחסן ב -20 ° C. הימנע מחזורי הקפאה / הפשרה חוזרים ונשנים של פלסמידים; השתמש aliquots פעמיים לפני השלכתם.

3. הכנת ננו-להב

1. ביום הראשון, זרעו בין 3.5 ל-4 × 10⁶ תאי HEK293T (ראו טבלת חומרים) ב-10 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל גלוקוז גבוה, נתרן פירובט, L-גלוטמין, 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ופניצילין/סטרפטומיצין בצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ. הזיזו את הצלחת בקוטר 10 ס"מ בעדינות קדימה ואחורה, ואז מימין לשמאל (חזרו על רצף זה פי 5) כדי לפזר תאים בצורה הומוגנית על צלחת התרבית. לדגור על תאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור תאים עם 5% CO₂.
   הערה: כל ההליכים הקשורים לטיפול בתאים בתרבית וננו-להבים צריכים להתבצע תחת מכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית תאים כדי למנוע את זיהומם.
2. יום 2: טרנספקציה פלסמיד
   1. התאים צריכים להיות במפגש של 70-80% 24 שעות לאחר הציפוי (איור 1A). החלף את המדיום עם 10 מ"ל של DMEM טרי המכיל גלוקוז גבוה, פירובט נתרן, L-גלוטמין, 10% FBS (פניצילין וסטרפטומיצין ניתן להשמיט למרות שזה לא חובה) לפני transfection.
      הערה: בשלב זה, חשוב שהתאים לא יהיו חופפים. אחרת, יעילות הטרנספקציה, כמו גם ייצור החלקיקים יכולים להיות מופחתים.
   2. עבור כל צלחת בקוטר 10 ס"מ, הכינו את הכמויות הבאות של פלסמידים בצינור של 1.5 מ"ל: 0.3 מיקרוגרם pCMV-VSV-G, 0.7 מיקרוגרם pBaEVRless, 2.7 מיקרוגרם MLV Gag/Pol, 1.7 מיקרוגרם BIC-Gag-Cas9, 4.4 מיקרוגרם של פלסמיד BLADES או SUPERBLADES המקודד את ה-sgRNA המשובט (או 2.2 מיקרוגרם כל אחד אם משתמשים בשני sgRNA).
   3. הוסף 500 μL של חיץ טרנספקציה (ראה טבלת חומרים), מערבולת עבור 10 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 1 s. הוסף 20 μL של מגיב transfection (ראה טבלת חומרים), מערבל את הצינור עבור 1 s, ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 1 s.
   4. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולהוסיף את התמיסה כולה לתאים בתווך DMEM באמצעות פיפטור P1000. הזיזו את הצלחת בקוטר 10 ס"מ בעדינות קדימה ואחורה, ואז מימין לשמאל (חזרו על רצף זה פי 5) כדי לפזר באופן אחיד את מגיב הטרנספקציה על פני התאים. לדגור על תאים ב 37 ° C במשך 40 שעות לפחות באינקובטור תאים עם 5% CO₂.
      הערה: אם תרצה, בינוני ניתן לשנות 4 שעות לאחר transfection.
3. ביום השלישי, בדקו את המורפולוגיה של התאים הנגועים תחת המיקרוסקופ.
   הערה: תאי היצרן יתחילו להתמזג. זוהי תופעה נורמלית כתוצאה מביטוי של מעטפות נגיפיות פוזוגניות (איור 1B,C).
4. יום 4: קצירת ננו-להבים
   הערה: לפחות 40 שעות לאחר הטרנספקציה, התאים היו מתמזגים יחד בגלל ביטוי של מעטפות הנגיפים הפוסוגניים, ולפעמים התאים מנותקים לחלוטין מתמיכת הצלחת (איור 1D).
   1. לאסוף 9 מ"ל של supernatant מדיום תרבית באמצעות פיפטה 10 מ"ל.
      הערה: ננו-להבים הם VLPs המסוגלים להעביר את חלבון Cas9 ואת ה-sgRNA הקשור אליו לתאים ראשוניים ו-in vivo. למרות שהם אינם נחשבים אורגניזמים מהונדסים גנטית כפי שהם נטולי חומר גנטי, הם יכולים לגרום לשינויים גנטיים. לכן, יש לתפעל אותם בזהירות כדי למנוע כל מגע עם משתמשים (במיוחד אם הם מתוכנתים להתמקד בגנים מדכאי גידול). מומלץ למשתמשים לעקוב אחר הנחיות הבטיחות המקומיות שלהם למניפולציה של וקטורים רטרו-ויראליים ולעבוד במעבדה ברמת BSL-2 בעת הכנת VLPs וביצוע ניסויי התמרה (transduction). ננו-להבים יכולים להיות מנוטרלים עם 70% אתנול או 0.5% של נתרן היפוכלוריט. מומלץ גם לטפל בכל פסולת הפלסטיק (קצות פיפטה, צלחות תרבית רקמות, צינורות צנטריפוגה) עם 0.5% נתרן היפוכלוריט למשך 10 דקות לפחות כדי להשבית את הננו-להבים.
   2. צנטריפוגה את הסופרנאטנט שנאסף ב 500 × גרם במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת תאית ולשחזר את supernatant מבלי להפריע את כדור התא.
      הערה: אם ננו-להבים מיועדים לשימוש בתאים ראשוניים, סנן את הסופרנאטנט באמצעות מסנן של 0.45 מיקרומטר או 0.8 מיקרומטר. שים לב כי צעד זה מפחית באופן דרסטי את titer Nanoblade כמו חלק משמעותי יהיה חסום בקרום המסנן.
   3. הפילו את הננו-להבים למשך הלילה (12-16 שעות) ברוטור דלי מתנדנד במשקל 4,300 × גרם או ב-209,490 × גרם באולטרה-צנטריפוגה למשך 75 דקות ב-4°C (ראו טבלת חומרים).
      הערה: אם תאי המטרה יכולים לגדול ב-DMEM, ניתן לדגור עליהם ישירות עם הסופרנאטנט המתקבל לאחר שלב 3.4.2 מבלי לרכז את הננו-להבים.
5. יום 5: השעיה ואחסון של Nanoblades
   1. לאחר הצנטריפוגה, לשאוף לאט את התווך ולהשהות מחדש את הגלולה הלבנה עם 100 μL של מי מלח קרים 1x פוספט חוצץ (PBS). מכסים את הצינור בפרפילם, ודגרים במשך שעה אחת ב-4°C עם תסיסה עדינה לפני השעיית הגלולה מחדש על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
      הערה: חומר צמיג לבן עשוי להופיע בעת ההשעיה; זה נורמלי ואינו משפיע באופן משמעותי על יעילות הטרנסדוקציה.
   2. אחסנו את הננו-להבים בטמפרטורה של 4°C אם אתם מתכננים להשתמש בהם תוך ארבעה שבועות. אחרת, הקפיא את הננו-להבים בחנקן נוזלי ואחסן אותם בטמפרטורה של -80°C.
      הערה: יש ללבוש משקפי מגן וכפפות קריוגניות בעת מניפולציה של חנקן נוזלי. הקפאת הצמדה ואחסון בטמפרטורה של -80°C מובילים לירידה משמעותית ביעילות הננו-להב. יתר על כן, Nanoblades מופשר לא צריך להיות קפוא שוב. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

4. ריכוז ננו-להבים על כרית סוכרוז

הערה: כחלופה לצנטריפוגה או אולטרה-צנטריפוגה בלילה (שלב 3.4.3), ניתן לרכז את הננו-להבים בכרית סוכרוז. זה מניב חלק טהור יותר של Nanoblades, אם כי הסכום הכולל שיוחזר יהיה נמוך יותר.

1. הכינו תמיסת 10% סוכרוז (משקל לנפח) ב-PBS אחד, וסננו אותה דרך מסנן מזרקים 0.2 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים).
2. התחל בתהליך ריכוז הננו-להבים על כרית הסוכרוז.
   1. הכניסו 9 מ"ל של דגימה המכילה VLP (משלב 3.4.3) לצינור אולטרה-צנטריפוגה (ראו טבלת חומרים). באמצעות מזרק וצינורית 3 מ"ל, שכבה איטית של 2.5 מ"ל של 10% סוכרוז מתחת לדגימה, מנסה לא לערבב את הדגימה המכילה VLP ואת תמיסת הסוכרוז.
   2. לחלופין, הכניסו 2.5 מ"ל של 10% סוכרוז לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה (ראו טבלת חומרים). הטה את הצינור והוסף באיטיות את 9 מ"ל הדגימה המכילה VLP (משלב 3.4.3) עם פיפטור במהירות נמוכה. במהלך פעולה זו, בהדרגה להרים את הצינור למצב אנכי.
3. צנטריפוגה הדגימות ב 209,490 × גרם באולטרה צנטריפוגה במשך 90 דקות ב 4 ° C.
   הערה: ניתן להתאים טכניקה זו לצנטריפוגה במהירות נמוכה (4,300 × גרם) למשך הלילה.
4. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנאטנט בזהירות והנח את הצינור הפוך על נייר טישו כדי להסיר את שאריות הנוזל. לאחר 1 דקה, להוסיף 100 μL של 1x PBS ולהניח את הצינור על 4 ° C עם כיסוי parafilm מחזיק צינור על שולחן תסיסה במשך 1 שעה (ראה את טבלת החומרים) לפני resuspending את הגלולה על ידי pipeting למעלה ולמטה.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

5. ניטור טעינת Cas9 בתוך Nanoblades על ידי dot-blot

1. הכינו את מאגר הדילול על ידי הוספת נפח אחד של חיץ ליזיס המכיל חומר פעילי שטח לא יוני (ראו טבלת חומרים) ב-4 כרכים של 1x PBS. לדלל 2 μL של ננו-להבים מרוכזים ב-50 μL של חיץ דילול, מערבולת לזמן קצר, ולהעביר 25 μL של תערובת זו לתוך צינור חדש המכיל 25 μL של חיץ דילול. חזור על פעולה זו כדי לקבל 4 צינורות של דילול Nanoblade (שלבי דילול פי 2).
2. עבור הבקרות הסטנדרטיות, לדלל 2 μL של נוקלאז Cas9 רקומביננטי (ראה טבלת החומרים) לתוך 50 μL של מאגר דילול, מערבולת לזמן קצר, ולהמשיך לבצע שמונה דילולים סדרתיים (דילול פי 2 עבור כל שלב).
3. יש לזהות בזהירות 2.5 μL של כל דילול VLP ו-2.5 μL של כל תקן על קרום ניטרוצלולוז עם צינור רב ערוצי (נפח גדול יותר עלול לגרום לכתמים חופפים).
   הערה: ניתן להשתמש גם בקרום פוליווינילדיפלאוריד המטופל במתנול.
4. לאחר שהחלקיקים נספגים על הממברנה, חסום את הממברנה עם 1x Tris-buffered מלוחים המכילים חומר פעילי שטח לא יוני (TBS-T) בתוספת חלב יבש ללא שומן (5% w/v) למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, ואת הממברנה לאחסן ב 4 ° C ב 1x TBS-T.
5. יש להשליך את 1x TBST בתוספת חלב יבש ללא שומן, ולדגור על הממברנה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדן Cas9-horseradish peroxidase (דילול 1/1000 ב-1x TBST, 5% חלב). שטפו את הממברנה 3x עם TBS-T, ודמיינו את האות באמצעות ערכת מצע כימילומינסנטית משופרת.
6. כמת את עוצמת הנקודה עבור Nanoblades ודילולים סטנדרטיים רקומביננטיים Cas9 באמצעות התוכנה הקניינית שסופקה עם תחנת ההדמיה ג'ל או imageJ. הגדירו עקומה ליניארית המקשרת בין עוצמת הנקודה לריכוז Cas9. באמצעות הפונקציה של העקומה המתקבלת, אקסטרפולציה התוכן Cas9 בכל הכנה.
   הערה: כמות הבקרה הרקומביננטית של חלבון Cas9 יכולה להרוות את הקריאה עבור הדגימות המרוכזות ביותר של קבוצת הדילול הסטנדרטית (איור 2). לכן מומלץ, בעת הגדרת העקומה הליניארית, להסיר את הקריאה מהדגימות הלא מדוללות (ולעיתים זו של שלבי הדילול הראשונים) אם הן אינן בטווח הליניארי ביחס לריכוז הידוע של Cas9 שזוהה. באופן דומה, בעת חישוב כמות Cas9 בתוך דגימות Nanoblade, השתמש רק בקריאות שנמצאות בטווח הליניארי של העקומה הסטנדרטית.

6. התמרה של תאי מטרה עם Nanoblades (הליך התמרה בצלחת 12 בארות)

1. בצלחת של 12 בארות, זרעו 100,000-200,000 תאים (תאים דבקים ראשוניים או אימורטליים) לכל באר ב 1 מ"ל של מדיום תרבית התאים המתאים. אפשרו לתאים להיצמד לפני השטח של הצלחת לפני ההתמרה.
2. בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, הוסף 5-20 μL של ננו-להבים מרוכזים (משלב 3.5.1 או 4.4) ל-500 μL של תווך תרבית תאים, וערבב על-ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם פיפטור P1000. הסר את המדיום מהתאים, והחלף אותו ב- 500 μL של תערובת Nanoblade זו.
   הערה: התמרה חייבת להיות ממוטבת עבור כל סוג תא. חשוב להשתמש בנפח הקטן ביותר האפשרי של מדיום (תוך הימנעות מייבוש של תאי המטרה) כך שהננו-להבים יישארו מרוכזים מאוד. תאים דבקים חייבים להיות מומרים ישירות בזמן שהם מחוברים לצלחת (אין להמיר בתרחיף מכיוון שהדבר יפחית משמעותית את יעילות הטרנסדוקציה). חלק מהתאים סובלים חשיפה ממושכת לננו-להבים (24-48 שעות) בעוד שאחרים רגישים מאוד ועשויים ליצור סינסיטיה קטנה. במקרה זה, Nanoblades חייב להיות מודגר עם תאים רק במשך 4-6 שעות לפני החלפת המדיום. ספינוקולציה יכולה גם לשפר את ההתמרה של תאים הגדלים בתרחיף. אדג'ובנטים כגון פולימרים קטיוניים (ראו טבלת חומרים) יכולים גם לשפר את יעילות ההולכה בסוגי תאים מסוימים.
3. לאחר 4-6 שעות של דגירה של תאים בנפח נמוך של מדיום המכיל Nanoblades, להגדיל את נפח המדיום לכמות הרגילה (1 מ"ל אם עובדים עם צלחת 12 באר), או להחליף אותו עם מדיום טרי אם התאים רגישים VLPs.
   הערה: תווך התא המכיל Nanoblades חייב להיות מנוטרל עם 0.5% hypochlorite נתרן במשך 10 דקות לפני השלכתו. השתמש בכפפות ובמשקפי מגן בעת מניפולציה של נתרן היפוכלוריט. אם ננו-להבים גורמים למוות תאי, התאימו את כמות וזמן החשיפה הכולל כדי להפחית את תמותת התאים.

תוצאות

איור 1: מורפולוגיה של תאי יצרן במהלך ייצור ננו-להבים.(A) HEK293T תאים במפגש של 70-80% 24 שעות לאחר הציפוי. (ב ו-ג) HEK293T מורפולוגיה של התא 24 שעות לאחר הטרנספקציה. (D) HEK293T מורפולוגיית התא 40 שעות לאחר הטרנספקציה. פסי קנה מידה = 400 מיקרומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
13.2 מ"ל, צינורות פוליפרופילן דקים, 14 x 89 מ"מ - 50Pk	בקמן קולטר מדעי החיים	331372	צינורות אולטרה-צנטריפוגה לטיהור ננו-להבים
Amersham Protran Premium ממברנות הכתמה מערביות, ניטרוצלולוז	מרק	GE10600004	קרום ניטרוצלולוז לכימות רמות Cas9 בתוך ננו-להבים מטוהרים
BIC-Gag-CAS9	אדג'ין	119942	מקודד מיזוג GAG (F-MLV)-CAS9(SP). מאפשר ייצור של נגיף GAG-CAS9 כמו חלקיקים מתאי יצרן בשילוב עם gRNA(s) מבוטא יתר ומעטפות מתאימות
BICstim-Gag-dCAS9-VPR	אדג'ין	120922	קידוד מיזוג GAG-dCAS9-VPR להפעלת שעתוק ממוקדת
להב	אדג'ין	134912	עמוד שדרה ריק לשיבוט רצף sgRNA לשימוש במערכת Nanoblades
BsmBI-v2	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	R0739S	אנזים הגבלה לעיכול וקטורי BLADE ו-SUPERBLADES לשיבוט sgRNA
Cas9 (7A9-3A3) עכבר mAb (HRP מצומד) #97982	טכנולוגיית איתות תאי	97982S	נוגדן Anti-Cas9 לכימות Cas9 על ידי כתם נקודה
Cas9 Nuclease, S. pyogenes	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	M0386T	חלבון Cas9 רקומביננטי שישמש כנקודת ייחוס לכימות מוחלט של כמות Cas9 הטעונה בתוך ננו-להבים
תמיסת אתידיום ברומיד (10 מ"ג/מ"ל ב-H2O)	סיגמא-אולדריץ'	E1510-10ML	לצביעת ג'ל אגרוז ולדמיין DNA
Fisherbrand Wave Motion Shakers	פישר סיינטיפיק	88-861-028	טבלת תסיסה להשעיה מחדש של ננו-להבים בצנטריפוגה
gelAnalyzer			http://www.gelanalyzer.com; כימות עוצמת הרצועה לאחר העיכול
Gesicle מפיק 293T	טאקרה	632617	קו תאי יצרן Nanoblades
Gibco DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט	תרמופישר סיינטיפיק	41966052	מדיום תרבית תאים עבור Gesicle Producer 293T תאים
ערכת מגיב transfection jetPRIME עבור DNA ו- DNA/siRNA	פוליפלוס	POL114-15	מגיב טרנספקציה לייצור ננו-להבים בתאי Gesicle Producer 293T
Millex-AA, 0.80 מיקרומטר, מסנן מזרקים	מיליפור	SLAA033SS	מסנן מזרק להסרת פסולת תאית לפני ריכוז Nanoblades
Millex-GS, 0.22 מיקרומטר, מסנן מזרקים	מיליפור	SLGS033SS	מסנן מזרק לעיקור תמיסת כרית הסוכרוז
Millex-HP, 0.45 מיקרומטר, פוליאתרסולפון, מסנן מזרקים	מיליפור	SLHP033RS	מסנן מזרק להסרת פסולת תאית לפני ריכוז ננו-להבים
ערכת מיצוי ג'ל DNA של Monarch	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	T1020L	ערכת מיצוי ג'ל DNA לטיהור מקטע פלסמיד pBLADES או pSUPERBLADES בעת העיכול עם BsmBI
NEB יציב E. coli (יעילות גבוהה)	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	C3040I	חיידקים מוכשרים לשינוי והגברה של פלסמיד
ערכת NucleoBond Xtra Midi לדנ"א פלסמיד בדרגת טרנספקציה	מכרי-נגל	740410.5	ערכת Maxipreparation לטיהור DNA פלסמיד מחיידקים בתרבית
ערכת מיצוי gDNA נוקלאוספין	מכרי-נגל	740952.5	מיצוי DNA גנומי מתאים מותמרים
NucleoSpin Plasmid, ערכת מיני לדנ"א פלסמיד	מכרי-נגל	740588.5	ערכת מיני-הכנה לטיהור DNA פלסמיד מחיידקים בתרבית
רקמת NucleoSpin, ערכת מיני לדנ"א מתאים ורקמות	מכרי-נגל	740952.5	ערכת מיצוי DNA גנומי
אופטימה XE-90	בקמן קולטר מדעי החיים	A94471	אולטרה-צנטריפוגה
pBaEVRless	Els Verhoeyen (Inserm U1111)	בקשות אישיות יש לשלוח אל: els.verhoyen@ens-lyon.fr	בבון רטרו-וירוס אנדוגני Rless גליקופרוטאין המתואר ב- Girard-Gagnepain, A. et al. מעטפת בבון LVs פסאודו-טייפ עולים בביצועיהם על VSV-G-LVs עבור העברת גנים ל- HSCs המעוררים ציטוקינים מוקדמים ומנוחה. דם 124, 1221–1231 (2014)
pBS-CMV-gagpol	אדג'ין	35614	Enocdes וירוס לוקמיה Murine gag ו pol גנים
pCMV-VSV-G	אדג'ין	8454	חלבון מעטפת לייצור חלקיקים רטרו-ויראליים לנטי-ויראליים ו-MuLV
מלח חוצץ פוספט (PBS)	תרמופישר סיינטיפיק	14200091	10X PBS לדלל במי מיליפור
מגיב טרנספקציה פוליברן	מיליפור סיגמא	TR-1003-G	פולימר קטיוני המשפר את יעילות הטרנסדוקציה הרטרו-ויראלית בתאי יונקים ספציפיים. זה יכול גם לאפשר כניסה תלוית ויראלי של אוליגודאוקסינוקלאוטיד (ODN) לתיקון מכוון הומולוגיה
סוכרוז, לביולוגיה מולקולרית, ≥99.5% (GC)	סיגמא-אולדריץ'	S0389-5KG	סוכרוז להכנת כרית לטיהור ננו-להבים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה
SUPERBLADE5	אדג'ין	134913	עמוד שדרה ריק לשיבוט רצף sgRNA לשימוש במערכת ננו-להבים (מותאם ליעילות מוגברת של עריכת גנום באמצעות Chen B et al., 2013)
מצע משך מורחב SuperSignal West Dura	תרמופישר סיינטיפיק	34076	מצע HRP משופר של כימילומינסנציה (ECL) עבור כתמי נקודות Cas9
SW 41 Ti סווינגינג-דלי רוטור	בקמן קולטר מדעי החיים	331362	רוטור לאולטרה-צנטריפוגה
SYBR כתם ג'ל DNA בטוח	תרמופישר סיינטיפיק	S33102	חלופה לאתידיום ברומיד לצביעת ג'ל אגרוז והדמיה של DNA
ליגאז DNA T4	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	M0202S	ליגאז DNA כדי לקשר את וקטורי BLADE או SUPERBLADES עם אוליגוס DNA דופלקס המתאים לאזור המשתנה של sgRNA
חיץ ליזה המכיל טריטון	פרומגה	E291A	חיץ ליזיס כדי לשבש Nanoblades ולאפשר כימות Cas9
טווין 20	סיגמא-אולדריץ'	P9416	להכנת TBST