מאמר שיטה

מיקרו-הזרקה של עובר יתוש: טכניקה להעברת DNA אקסוגני לחלמון עובר של אנופלס גמביה ליצירת מוטציות בקו הנבט

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Carballar-Lejarazú, R. et al, Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה, אנו מדגימים את העברת מבנה כונן הגן לעובר של יתוש אנופלס גמביה באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה עוברית. הליך זה מאפשר שילוב של מבנה DNA מועבר, באמצעות רקומבינציה הומולוגית, לתוך תאי הנבט כדי ליצור אוכלוסיית יתושים מותמרת.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מיקרו-הזרקה לעובר

  1. השתמשו בקצה מיקרו-מעמיס כדי למלא את המחטים ב-2 μL של תערובת דנ"א (דנ"א פלסמיד בריכוז של 300-400 ננוגרם/μL. הכניסו את המחט למחזיק המחט וחברו את צינור משאבת הלחץ האוטומטית (איור 1).
  2. חשוב: יישרו את המחט כך שהיא תיצור זווית של 15° עם מישור המגלשה (איור 1).
  3. פתח את קצה המחט על ידי נגיעה בזהירות בביצה הראשונה של יתוש אנופלס גמביה והזריק אותו על ידי החדרת קצה המחט ≤ 10 מיקרומטר בקוטב האחורי. הזרקה מוצלחת תוביל לתנועה קטנה של הציטופלסמה בתוך הביצית.
  4. השתמש בפקדי השלב הקואקסיאלי במיקרוסקופ כדי לעבור לביצית הבאה כדי להמשיך בהזרקה.
    1. כדי לוודא שקצה המחט נשאר פתוח ולא נסתם, לחץ על כפתור ההזרקה לפני הכניסה לעובר אחר ודמיינו את הטיפה הקטנה בפתח המחט.
    2. אם המחט נסתמת, לחץ על לחצן נקה כדי לנקות את המחט וחזור על בדיקת ההדמיה של טיפה. התאימו את הלחץ לפי הצורך אם פתח קצה המחט גדל מעט כדי להבטיח שגודל הטיפה יישאר קטן.
    3. להזריק ~ 40-50 ביצים עם מחט אחת.
      הערה: ודא שנייר הסינון נשאר לח בכל עת. שמור על לחץ גב מספיק על המחט כדי לשמור על ניקויה. מחט שלא ניתן לפתוח את הסתימה חייבת להיות מוחלפת במחט חדשה. מיקום העובר, החדרת המחט והזרקתו נעשים קלים יותר באמצעות מיקרוסקופים שיש להם בקרות קואקסיאליות לתנועה אופקית של השלב (איור 2).
  5. לאחר השלמת ההזרקות, שטפו את הביצים לתוך מיכל זכוכית מרופד בנייר סינון ומלא ב-50 מ"ל של H2O שעבר דה-יוניזציה (איור 3).
    הערה: עוברים יתחילו לבקוע יומיים לאחר ההזרקה ועשויים להימשך עד 3-5 ימים. יש להעביר מיד את הזחלים הראשונים שבקעו (לבדוק פעמיים ביום) למיכל נקי עם מים ומזון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: מיקום המחט במהלך המיקרו-הזרקות. א) זווית ראייה רחבה של שלב ההזרקה. B,C) מקם את המחט כך שהעוברים המיושרים יוצרים זווית של 15° עם מחט ההזרקה. אין להרים את זרוע מכשיר המיקרו-הזרקה המחזיק את המחט גבוה משמעותית משלב המיקרוסקופ כדי להבטיח זווית נכונה בין המחט לשקופית המכילה את העוברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10x Microinjection Buffer--1 mM NaHPO4 חוצץ, pH 6.8, 50 mM KCl
קרום הכתמים (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)ביו-ראדחתוך בצורה מסודרת וישרה לחתיכה בגודל 2x1 ס"מ
מים דה-יוניים או מזוקקים פעמיים (ddH20)מילי-קיובבקבוק שטיפה
מיקרוסקופ מנתחלייקהלייקה MZ12ליישור עוברים
מיכל זכוכיתפירקסמס' קטלוגי 3140125 x 65
שקופית זכוכיתפישר ברנדמס' 12-549-375x26 מ"מ
מיקרו-מזרקסאטר אינסטרומנטמזרק מיקרו-מזרק דיגיטלי XenoWorks
טיפים פיפטה Microloaderאפנדורף20 μL microloader epT.I.P.S.
מיקרומניפולטורסאטר אינסטרומנטXenoWorks Micromanipulator
מיקרופיפטהריינין20 מיקרוליטר
מיקרוסקופלייקהDM 1000 LED או M165 FCלמיקרו-הזרקה
רשת ניילון
מברשת צבעבליקטלפון: 05831-7040בסדר, גודל 4/0
צלחת פטריפלסטיק, (60x15 מ"מ, 90x15 מ"מ)

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAGene Drive

מאמרים קשורים