העברת גנים הידרודינמיים: טכניקה לטרנספקציה In vivo של DNA אקסוגני בהפטוציטים של מורין באמצעות הזרקת ורידי זנב

תקציר

מקור: Hubner, E. K. et al., Constitutive and Inducible Systems for Genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של טרנספקציה גנטית in vivo של הפטוציטים של מורין על ידי הזרקת ורידים הידרודינמיים בזנב. מערכת טרנספקציה זו יוצרת ביטוי ארוך טווח של הטרנסגן בהפטוציטים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת פתרון להזרקת וריד זנב הידרודינמי

הערה: הכן את מבני הפלסמיד לביטוי גנים מכונן ומושרה על ידי טכניקת שיבוט באמצעות חיידקים מתאימים.

1. הכינו תמיסת מלח סטרילית 0.9% להזרקה (אין להשתמש ב-PBS). השתמש בנפח המתאים לכ-10% ממשקל גוף העכבר. דוגמה: עבור עכבר במשקל 20 גרם, להכין 2 מ"ל של פתרון.
2. הכינו וקטורי הזרקה שטוהרו באמצעות ערכת טיהור פלסמיד ללא אנדוטוקסין.
3. הוסף 10 מיקרוגרם או 15 מיקרוגרם של מבנה וקטור היפהפייה הנרדמת ללא אנדוטוקסין (השתמש ב- 10 מיקרוגרם, משלב 4 השתמש ב- 15 מיקרוגרם, בהתאמה) ו- 1 מיקרוגרם של PC-HSB5 ללא אנדוטוקסין לכל מ"ל של מי מלח סטריליים.
4. יש לאחסן את התמיסה למשך עד 4 שעות ב-4°C. אין להקפיא.

2. ביצוע הזרקת ורידי זנב הידרודינמיים

1. השתמש ריסון עבור הזרקת ורידים הזנב (מסחרי או מוכן מתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם חורים לנשימה עבור הזנב). ממלאים את תחתית הצינור בנייר טישו.
2. להזרקה יש להשתמש בעכברים בני 8-10 שבועות במשקל של 20-25 גרם.
3. שוקלים עכברים לפני ההזרקה ומכינים נפח הזרקה בהתאם למשקל הגוף (המקביל ל-10% ממשקל הגוף). הכינו מזרק סטרילי 3 מ"ל עם מחט 27 G להזרקה ומלאו בנפח הנדרש.
4. הכנס את העכבר לרסן. התאימו את כמות נייר הטישו כך שישאירו רק מקום מינימלי לתנועה אך מספיק מקום לנשימה.
5. ודא שהעכבר נושם באופן קבוע.
6. חממו את הזנב באמצעות מנורת אינפרא אדום למשך 30-60 שניות. שימו לב היטב לסימנים של התחממות יתר.
7. נקו את הזנב עם ספוגית אלכוהול.
8. הכנס את המחט כמעט אופקית לאחד משני ורידי הזנב הרוחביים הקרובים לבסיס הזנב.
   הערה: אם מניחים אותו בהצלחה, כמות קטנה של דם עשויה לזרום חזרה לתוך חרוט המחט. לא מומלץ לשאוף באופן אקטיבי מכיוון שכל תזוזה נוספת של המחט עלולה לגרום לתזוזה ו/או פציעה של הווריד.
9. הזריקו את הנפח הכולל לווריד הזנב תוך 8-10 שניות.
10. הסר מיד את העכבר מהריסון. יש לדחוס את פצע ההזרקה למשך 30 שניות לפחות או עד שהדימום שוכך.
11. הכניסו את העכבר לכלוב נפרד. לאחר שהעכבר התאושש מההליך (כ-30-60 דקות), העבירו את העכבר בחזרה לכלוב המקורי שלו. בדוק את העכבר באופן קבוע במשך 24 השעות הבאות /<> הערה: הרגעה קלה של העכבר נצפתה באופן שגרתי עד שעתיים לאחר ההזרקה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
NaCl 0,9%	בראון	3200905	נשא לזריקות תוך ורידי
צינור חרוטי בז 50 מ"ל	קורנינג מדעי החיים	352095
מנורת אינפרא אדום	לא ישים	לא ישים	לחימום זנב העכבר
פלסמידים לשיבוט וקטורי טרנספוזון של היפהפייה הנרדמת עבור HTVI.
pTC	לא ישים		וקטור לביטוי גנים מכונן
pEN_TTmcs	אדג'ין	#25755	וקטור כניסה לביטוי גנים מושרה
pEN_TTGmiRc2	אדג'ין	#25753	וקטור כניסה לביטוי miRshRNA מושרה עם ביטוי משותף של GFP
pEN_TTmiRc2	אדג'ין	#25752	וקטור כניסה לביטוי miRshRNA מושרה ללא ביטוי משותף של GFP
pTC ApoE-Tet	אדג'ין	#85578	וקטור ביטוי עבור גן מושרה או ביטוי miR-shRNA עם ApoE.HCR.hAAT promotor
pTC-CMV-טט	אדג'ין	#85577	וקטור ביטוי לביטוי גן מושרה או miR-shRNA עם פרומוטור CMV