טרנספורמציה גנטית בתיווך אגרובקטריום: שיטה לשינוי גנטי של גנום האורז באמצעות גידולי אגרובקטריום מהונדסים גנטית

תקציר

מקור: Xu, D., et al. Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice. J. Vis. Exp. (2020).

בסרטון זה אנו מדגימים טרנספורמציה גנטית של גנום האורז באמצעות וקטור בינארי Agrobacterium tumefaciens. חיידק זה מאפשר העברה של פלסמיד DNA זר באמצעות חלבוני אלימות אגרובקטריום.

פרוטוקול

1. טרנספורמציה גנטית של אורז ותרבית רקמת צמחים

1. השראת יבלות והתחדשות
   הערה: השתמשו בתפרחות אורז צעירות וטריות כחומר מוצא להשראת יבלות (איור 1).
   1. אספו את התפרחות הצעירות משדה האורז או מהבית הירוק בשלב המיוזה, שנקבע לפי אורך הפרחים של 1.6-4.8 מ"מ (איור 1A). ודאו שתפרחות האורז מכוסות בנדן עלים. נגבו כל תפרחת במקלון אלכוהול 70% ותנו לה להתייבש לפני החיתוך.
   2. מביאים את התפרחת לספסל סטרילי נקי. חתכו אותו לחתיכות קטנות (כמה שיותר קטן יותר טוב) עם מספריים מעוקרים ואז העבירו את החיתוכים לצלחת פטרי שמכילה מדיום NBD2 (איור 1B, טבלה 1).
   3. דגרו על הצלחת בחושך בטמפרטורה של 26°C במשך כ-10-14 ימים כדי לגרום ליבלות (איור 2A).
      הערה: השתמש ביבלת החדשה שנוצרה עבור חדירת Agrobacterium (שלב 1.2.7) ישירות או recondition פעם נוספת בתווך NBD2 טרי כדי לקבל יותר callus. העבירו את היבלת למדיום NBD2 החדש כל 8-10 ימים.
2. טרנספורמציה וטיפוח משותף
   1. השתמש בחיידקי A. tumefaciens המכילים את הפלסמיד הבינארי עם מבנה sgRNA-CAS9 לצורך טרנספורמציה. אחסנו את זני A. tumefaciens בתווך YEB (טבלה 1) עם 50% גליצרול בטמפרטורה של -80°C לשימוש נוסף.
   2. פס A. tumefaciens ממלאי גליצרול של -80 מעלות צלזיוס למדיום אגר YEB המכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית (טבלה 1) וגדל ב 25-28 ° C במשך 48-72 שעות, כדי לאפשר למושבות להופיע.
   3. יש לחסן מושבה בודדת מצלחת YEB באנטיביוטיקה סלקטיבית עד 5 מ"ל של תווך YEB נוזלי המכיל את אותה אנטיביוטיקה סלקטיבית (טבלה 1), במבחנה סטרילית חרוטית של 50 מ"ל. יש לנער על שייקר אורביטלי במהירות של 250 x גרם, בטמפרטורה של 25-28 מעלות צלזיוס עד שהחיידקים גדלים ל-OD₆₀₀ של 0.5.
   4. הוסף 1 מ"ל של תרחיף חיידקי ל- 100 מ"ל של מדיום YEB (טבלה 1) עם אותה אנטיביוטיקה סלקטיבית בבקבוק חרוטי של 250 מ"ל ונער על שייקר אורביטלי ב- 250 x גרם, ב- 28 ° C במשך 4 שעות.
   5. צנטריפוגה בגודל 4,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לאיסוף חיידקים. השליכו את הסופרנטנט.
   6. השהה מחדש את כדורית החיידקים עם מדיום AAM-AS (טבלה 1) ודלל את המתלה ל- OD₆₀₀ = 0.4.
      הערה: OD המושלם של מתלים חיידקיים הוא קריטי לשינוי יעיל. זה עוזר לחסל צמיחה חיידקית עודפת על callus.
   7. אספו כ-150 קאלי עוברי שביר צהוב-בהיר בריא משלב 1.1.3 לצלוחית סטרילית בנפח 150 מ"ל. הוסף 50-75 מ"ל תרחיף תאי חיידקים משלב 1.2.6 לתוך הצלוחית הסטרילית, ולאחר מכן הוסף כ 10-25 מ"ל מדיום AAM-AS טרי כדי לטבול את הקלי במשך 10-20 דקות, רועד מדי פעם.
   8. יוצקים את התרחיף החיידקי מהבקבוק בזהירות ומייבשים את עודפי התרחיף החיידקי מהיבלת באמצעות נייר סינון סטרילי #1 או נייר טישו. לאחר מכן הניחו אותם על צלחת פטרי עם מדיום NBD-AS (טבלה 1) מכוסה בנייר סינון סטרילי #1. יש לדגור בטמפרטורה של 25-28 מעלות צלזיוס בחושך למשך 3 ימים ולבדוק צמיחת יתר של חיידקים.
3. בחירה עבור יבלות עמידות
   1. לאחר 3 ימים של טיפוח משותף, מעבירים את הקלי לצלחת פטרי סטרילית עם נייר סינון סטרילי.
   2. ייבשו באוויר את הקלי במשך שעתיים על ספסל נקי. ודא שהקאלוס אינו מודבק לנייר הסינון.
   3. העבירו את הקלי באופן שווה באמצעות פינצטה סטרילית למדיום הבחירה הראשוני NBD2 (עם היגרומיצין של 40 מ"ג/ליטר וטיימנטין של 250 מ"ג/ליטר) (טבלה 1). תרבות calli במשך 2 שבועות ב 25-28 מעלות צלזיוס בחושך.
   4. לאחר שבועיים, העבירו את הקלי באופן שווה לצלחת חדשה המכילה מדיום בחירה טרי NBD2 (עם 40 מ"ג/ליטר היגרומיצין ו-250 מ"ג/ליטר טימנטין) (טבלה 1). תרבית את הקלי במשך שבועיים נוספים ב 25-28 מעלות צלזיוס בחושך.
4. הבחנה בין יבלות
   1. העבירו את היבלות לטרשת נפוצה טרייה בינונית (עם 25 מ"ג/ליטר היגרומיצין ו-150 מ"ג/ליטר טיימנטין) (טבלה 1). תרבית תחת האור ב 25-28 מעלות צלזיוס במשך כשבועיים.
   2. חזור על שלב 1.4.1 פעם נוספת.
   3. העבירו את ניצני הצילום למדיום החדש של טרשת נפוצה (עם היגרומיצין של 10 מ"ג/ליטר) כדי להרבות יותר יורים.

טבלה 1: קומפוזיציות מדיה לשינוי אורז. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

תוצאות

איור 1: חומרי מוצא להשראת יבלות. (A) תפרחות אורז צעירות בשלב המיוזה. (B) תפרחות צעירות מנותחות הגדלות בתווך NBD2. בר = 2 ס"מ (A).

תרשים 2: הליך ליצירת קווים טרנסגניים על ידי טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום. (A) קאלי אורז שנוצר מהתפרחות הצעירות....