Electroporation-Mediated in Vitro Gene Delivery: טכניקת פולס חשמלי להחדרת פלסמידים מקודדי חלבון פלואורסצנטיים לתאים בתרבית

תקציר

מקור: Lo, J. C. W. et al., שיטת אלקטרופורציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי ציליום בקודמן תא הגרגיר.J. Vis. Exp.(2021)

סרטון זה מדגים את טכניקת האלקטרופורציה המציגה DNA פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי למבשרי תאי גרגיר המוח הקטן הראשוניים של עכבר.

פרוטוקול

1. אלקטרופורציה לביטוי יתר של קולטן Hh: pEGFP-Smo

1. עבור אלקטרופורציה באמצעות קובטת רווח של 2 מ"מ, הכינו את תערובת האלקטרופורציה הבאה של תאי פלסמיד לכל תגובה של אלקטרופורציה: 1.2 × 10⁶ תאים מבשרי תאי גרגיר המוח הקטן הראשוניים של עכבר ו-10 מיקרוגרם של pEGFP-mSmo (התאימו את ריכוז מלאי הדנ"א ל~2-5 מיקרוגרם/μL במאגר Tris-EDTA או dH_{סטרילי 2}O) ב-100 מיקרוליטר של Opti-MEM.
   הערה: הפחת את מספר התאים הכולל אם התאים אינם מספיקים (אם כי הדבר עלול להפחית את יעילות האלקטרופורציה). עם זאת, אין לכוונן את כמות הפלסמיד או את הנפח הכולל של Opti-MEM המשמש לקובט. אם מספר התאים הכולל הדרוש לניסוי עולה על 1.5 × 10⁶ תאים, הגדילו את תערובת האלקטרופורציה בהתאם ובצעו תגובות אלקטרופורציה מרובות בנפרד. ניתן לעשות שימוש חוזר בקובט עד 5 פעמים.
2. הכינו את צלחת זריעת התאים שלאחר האלקטרופורציה על ידי הוספת 0.5 מ"ל של מדיום תרבית לכל באר של צלחת התרבית בת 24 הקידוחים המכילה כיסויים מצופים ושמרו אותה חמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור CO₂. כדי להכין את הכיסויים לחיבור תאים, יש לדגור על כיסויי זכוכית בקוטר 12 מ"מ עם 100 מיקרוגרם/מ"ל פולי-D-ליזין (PDL, 1 מ"ג/מ"ל ב-dH_{סטרילי 2}O) למשך שעה אחת לפחות ב-37°C. יש לשמור את הכיסויים באותה תמיסת PDL בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
3. פיפטה את מספר התאים הנדרש לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל ולהסתובב ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב RT. להשליך את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 200 μL של Opti-MEM. חזור על שלב זה פעמיים עם Opti-MEM כדי לוודא שאין מדיום תרבית שיורית בצינור.
   הערה: עבור כל באר / כיסוי של צלחת 24 בארות, אלקטרופורטים וזרעים 1.2-1.3 × 10⁶ תאים / באר כדי לקבל ~ 70-75% מפגש תאים ביום הבא של התרבית.
4. הגדר את הפרמטרים של אלקטרופורציה כפי שמוצג בטבלה 1.
5. פיפטה את תגובת האלקטרופורציה בעדינות כדי לערבב היטב ולהשתמש בקצה P200 ארוך כדי להעביר נפח מדויק של 100 μL של התערובת לתוך קובטת רווח 2 מ"מ. הימנעו מיצירת בועות.
6. מניחים את הקובטה בתא הקובטה.
7. לחץ על כפתור Ω של האלקטרופורטור (ראה טבלת חומרים) ורשום לעצמך את ערך העכבה, שאמור להיות ~30-35. כדי להבטיח את ערך העכבה החשמלית Ω בטווח של 30-35, לדבוק נפח מדויק של 100 μL.
8. לחץ על לחצן התחל כדי להפעיל את הדופק.
9. רשום את ערכי הזרם הנמדד והג'אול המוצגים במסגרת הקריאה.
10. מוציאים את הקובט מתא הקובטה.
11. הוסיפו מיד 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית שחומם מראש לקובט והשהו אותו מחדש על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה 2-3 פעמים. העבר מיד את מתלה התא לצלחת 24 בארות המכילה כיסויים מצופים שהוכנו בשלב 1.2.
    הערה: כדי למזער מוות תאי, זרעו את התאים מיד לאחר ההתחשמלות.
12. לדגור על התאים ב 37 ° C באינקובטור CO₂. השאירו את התאים ללא הפרעה למשך 3 שעות כדי למנוע ניתוק תאים.
13. ב-3 שעות לאחר הזריעה, שאפו בעדינות והשליכו מחצית מהתווך הסופרנאטנטי כדי להסיר תאים מתים צפים ופסולת והחליפו באותה כמות של מדיום תרבית שחומם מראש.
14. לדגור על התאים ב 37 ° C באינקובטור CO₂.

	הגדרת דופק נקבובי		Transfer Pulse Setting
	GCPs ראשיים של עכבר	תאי עצב ראשוניים	GCPs ראשיים של עכבר	תאי עצב ראשוניים
מתח	275 וולט	275 וולט	20 V	20 V
אורך	1 מטר/שניה	0.5 מטר/שניה	50 מטר/שניה	50 מטר/שניה
מרווח זמן	50 מטר/שניה	50 מטר/שניה	50 מטר/שניה	50 מטר/שניה
לא.	2	2	5	5
קצב D	10%	10%	40%	40%
קוטביות	+	+	±	±

טבלה 1: פרמטרי האלקטרופורציה של GCPs ראשוניים של עכברים ונוירונים ראשוניים באמצעות Super Electroporator NEPA21 TYPE

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוסף B27	לייף טכנולוגיות בע"מ	17504044
GlutamMAXTM-I ,100x	גיבקו, לייף טכנולוגיות	35050061	L-תחליף גלוטמין
מטריג'ל	BD Biosciences	354277	מטריצת קרום מרתף
נוירובזל	גיבקו, לייף טכנולוגיות	21103049
פולי-D-ליזין הידרוברומיד	סיגמא אולדריץ'	P6407
תא קובטה CU 500	נפגנה	CU500
קובטת אלקטרופורציה EPA (מרווח של 2 מ"מ)	נפגנה	EC-002
Opti-MEM	לייף טכנולוגיות בע"מ	31985070	מדיום סרום מופחת לטרנספקציה
pEGFP-mSmo	אדג'ין	25395
סופר אלקטרופורטור NEPA21 TYPE II במבחנה ובאלקטרופורציה של Vivo	נפגנה	צרפת	אלקטרופורטור