נוקלאופקציה של צורות טפילים: שיטת טרנספקציה מבוססת אלקטרופורציה להעברת חלבון פלואורסצנטי המקודד פלסמידים לגרעין ספורוזואיט

תקציר

מקור: Duan, C., et al. Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מתארים נוקלאופקציה, הליך טרנספקציה מבוסס אלקטרופורציה כדי להעביר DNA פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי לצורה ספורוזואיטית של טפיל איימריה עוף.

פרוטוקול

1. נוקלאופקציה של merozoites או sporozoites

1. הכנה לפני nucleofection של טפילים
   1. הכינו כ 10⁷ merozoites או sporozoites בצינור אחד. אם transfecting merozoites, להכין 3-4 צינורות.
   2. הכינו כמות של DNA פלסמיד או מקטע PCR מטוהר הגדול או שווה ל- 10 מיקרוגרם.
      הערה: הפלסמיד המשמש במחקר זה מכיל 2 גנים: חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר (EYFP) ודיהידרופולאט רדוקטאז תימידילט סינתאז הנגזר מטוקסופלזמה גונדי (TgDHFR-TS).
   3. הכינו 25U של אנזים הגבלה. אם פלסמידים הם ליניאריים, אנזים הגבלה יכול לשפר את יעילות transfection. אם הפלסמידים מעגליים, השמיטו את אנזים ההגבלה.
   4. הכן 85 μL של מאגר נוקלאופקציה (טבלה 1): ערבב 20 μL של מאגר נוקלאופקציה I ו- 1 מ"ל של מאגר נוקלאופקציה II והשתמש בחלק מהתמיסה. נפח המאגר הכולל הוא 100 μL.
2. נוקלאופקציה
   1. צנטריפוגה את sporozoite או merozoite השעיה ב 600 x גרם במשך 10 דקות. ואז להשליך את supernatant.
   2. בסדר הבא, הוסף 85 μL של חיץ טרנספקציה גרעינית, 10 מיקרוגרם של פלסמיד (מקטע PCR), ו 25 U של אנזים הגבלה (בדרך כלל 5 μL) לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל sporozoites או merozoites.
   3. מעבירים את המתלה לכוס טרנספקציה גרעינית. מכניסים את הכוס לחריץ העברה גרעינית.
   4. הפעל את התקן הנוקלאופקציה באמצעות לחצן ההפעלה ובחר את הליך ההעברה U-033. אם התקן הנוקלאופקציה מופעל במצב Free Program Choice, צא ממצב זה על-ידי לחיצה על לחצן X.
   5. כאשר התוכנית מסתיימת, לחץ על כפתור X של התקן nucleofection, ואת המסך אמור להציג אישור, המציין כי nucleofection מוצלח.
   6. הוסף 0.5-1 מ"ל של מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) לכוס הנוקלאופקציה כדי לעצור את התגובה ולהעביר את המתלה לצינור 1.5 מ"ל לאחר ערבוב עדין.

מאגר	הרכב
חיץ נוקלאופקציה I	ATP-דיסודיום 2 גרם, MgCl2-6H 2O 1.2 גרם, 10 מ"ל מים
מאגר נוקלאופקטיון II	KH2PO4 6 גרם, NaHCO3 0.6 גרם, גלוקוז 0.2 גרם, 500 מ"ל מים
*מים: מים מזוקקים

טבלה 1: הרכב חוצצים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	מקגין	CM15019
התקן Nucleofection	LONZA/AMAXA	90900012 (נוקלאופקטור II)
גלוקוז	סיגמא	מס' V900116
ATP-דיסודיום	סיגמא	A26209
תאית DE-52	סולארביו	C8350
KH2PO4	סיגמא	מס' V900041
צנטריפוגה במהירות נמוכה	בייג'ינג עידן ביילי צנטריפוגה ושות', בע מ	DT5-2
MgCl2	סיגמא	449164
NaHCO3	סיגמא	144-55-8
PBS	סולארביו	P1010
Sorvall Legend Micro 17 מיקרוצנטריפוגה	תרמופישר סיינטיפיק	75002430
טריפסין	סולארביו	T8150
Percoll (פתרון מלאי שיפוע DG)	GE שירותי בריאות	17-0891-09