$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הסר תאי קומולוס מביציות מופרות.
- תחת סטריאומיקרוסקופ, השתמשו בשני מזרקי אינסולין: הראשון להחזיק את האובידוקט והשני לקרוע את האמפולה ולפזר ביציות מופרות לתוך תמיסת העבודה היאלורונידאז.
- לוקחים את צינור הזכוכית המוכן לאיסוף ביצים ומחברים אותו לצינורית ולמסנן 0.22 מיקרומטר המותקן על השופר כדי לשאוף את כל הביצים. לאסוף את כל הביצים ולשטוף אותם על ידי מעבר רצוף לתוך 6 טיפות שונות של 100 μL של M2 בינוני.
- הכניסו ביצים מופרות שטופות לאינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% CO2 בתווך M16.
2. ביצוע פיפטות הזרקה
- השתמש צינורות נימי זכוכית דקים (10-15 ס"מ אורך) עם קוטר חיצוני של 1 מ"מ ומהדק נימי זה לתוך מושך micropipette אופקי.
הערה: ברוב מושכי הפיפטות האופקיים ניתן לכוונן 3 פרמטרים: עוצמת חום, כוח משיכה ועיכוב זמן בין חימום למשיכה. התאימו את הפרמטרים האלה כדי לקבל פירטים מוזרקים שדומים לאלה שמוצגים באיור 1A. עבור משתמשים המבצעים באופן שגרתי מיקרו-הזרקת DNA, השתמש בהגדרות הסטנדרטיות והתאם את ההשהיה בין חימום למשיכה כדי לשנות את הצורה הגלובלית של קצה הפיפטה.
3. ביצוע פיפטות אחיזה
- השתמש פיפטה הזרקה כדי להכין פיפטה מחזיק.
- מחברים פיפטה מזריקה למיקרופורג'. חותכים את פיפטה עם microforge כדי לקבל קצה סימטרי חד של 80 עד 100 מיקרומטר קוטר. לאחר מכן מלטשים את הקצה בחום על המיקרופורג' לקבלת צורה סימטרית עגולה ללא גדרות חדות.
4. הכנת פיפטת הזרקה המכילה את הווקטור הלנטיוויראלי
- צנטריפוגה את המתלה הווקטורי הלנטיוויראלי ב 160 x גרם במשך 2 דקות כדי פסולת גלולה לעתים קרובות נוכח מלאי lentiviral קפוא.
- לשחזר את supernatant ולהעביר אותו לתוך צינור חדש 0.5 מ"ל בארון בטיחות Class II.
- העבר 1 μL של supernatant לפיפטת הזרקה שהוכנה כמתואר בשלב 5 באמצעות Micro-loader.
- הגדר את פיפטת ההזרקה על מחזיק המכשיר של המיקרומניפולטור הימני. חבר את צינור האחיזה למיקרומניפולטור השמאלי.
הערה: טיטר הטרנסדוקציה של וקטור הלנטיויראלי יהיה בקורלציה ישירה עם יעילות ייצור המייסד. ליעילות גבוהה (>70%), השתמשו בווקטורים נגיפיים עם טיטר בטווח של 100 ננוגרם של חלבון p24 קפסיד/μL. כאשר הטיטר מבוטא כיחידות טרנסדוקציה (TU), הטיטר צריך להיות מעל 109 TU/mL. מלאי וקטור לנטיויראלי חייב להיות מיוצר על ידי טרנספקציה חולפת של תאי 293T עם פלסמיד אנקפסידציה p8.91, pHCMV-G, המקודד את וירוס stomatitis שלפוחית (VSV) גליקופרוטאין-G כמתואר בשיטות משלימות.
5. מיקרו-הזרקה
- יש להוציא 8 μL של מדיום M2 במרכז מגלשת שקע ולכסות בשמן פרפין קל (עובר נבדק) כדי למנוע אידוי.
- הכניסו 20 ביצים לטיפה כמה שפחות מפוזרות.
זהירות: אין ליצור בועות בעת הפקדת העוברים.
- ודא כי קצה פיפטת ההזרקה פתוח. אם לא, הקש על פיפטת ההזרקה עם פיפטת ההחזקה.
- הגדר את המיקרו-מזרק לזמן הזרקה של 20 s.
הערה: צמיגות ההשעיה הוויראלית מאפשרת הדמיה ברורה של פיזור הווקטור הנגיפי בחלל הפריביטלין. לחץ ההזרקה צריך להיות מותאם כדי למלא את כל החלל בתוך 20 שניות של הזרקה, אשר מייצג נפח של 10 עד 100 pL. לחץ ההזרקה לא יעלה על 600 hPa.
- שאפו ביצית מופרית אחת המכילה 2 גרעינים ו-2 גופים קוטביים עם פיפטה מחזיקה מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
- להזריק את הביצה עם microinjector בחלל perivitelline.
זהירות: אין לגעת בקרום הפלזמה עם מזרקת ההזרקה.
- הזריקו את כל הביצים המופרות הזמינות בקבוצות של 20 ביצים והניחו את הביצים המוזרקות מיד בתווך M16 שחומם מראש לתוך האינקובטור הלח של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% CO2.
הערה: יש לדגור על הביציות המוזרקות למשך 30 דקות לפחות לאחר ההזרקה לפני החזרת העוברים.
