העברת גנים לנטי-ויראליים בסיוע לייזר: טכניקה לחלחול ביציות מופרות של עכברים כדי להקל על העברת גנים לנטי-ויראליים

תקציר

מקור: Martin, N. P., et al. העברת גן לנטיויראלי בסיוע לייזר לביציות מופרות של עכברים. J. Vis. Exp. (2018).

בסרטון זה, אנו מדגימים חדירה בסיוע לייזר של שכבת ההגנה של zona pellucida בביציות מופרות של עכברים כדי להקל על העברת גנים lentiviral. לנטיוירוס מאפשר יצירת בעלי חיים טרנסגניים עם גן מעניין המשולב ביציבות בגנום שלהם.

פרוטוקול

1. ניקוב ביציות מופרות של עכבר בלייזר XYClone

1. הגדרה וכיול לייזר XYClone בהתאם להמלצת היצרן. לייזרים אחרים, המשמשים בדרך כלל להפריה חוץ גופית, יכולים להיות מוחלפים בלייזר XYClone לניקוב ביציות מופרות.
   1. חבר את חוט קופסת בקר הלייזר למכשיר הלייזר במיקרוסקופ.
   2. חבר את קופסת בקר הלייזר למחשב שבו פועלת תוכנת הלייזר באמצעות יציאת USB. 3.1.3. חבר את בקר הלייזר והפעל אותו.
   3. במבט דרך העינית, נקבו דגימת בדיקה (למשל סימוני מחיקה יבשה על שקופית זכוכית).
   4. השתמש במברג קטן (כלול בערכת הלייזר) כדי להתאים את מיקום X ו- Y של הלייזר כך שיתאים לאור ה- LED הנראה דרך עינית המיקרוסקופ ולכייל את הלייזר.
2. הניחו צלחת טיפת KSOM המכילה ביציות מופרות של עכבר על שלב המיקרוסקופ. אין לשמור את הצלחת מחוץ לאינקובטור למשך יותר מ-15 דקות.
3. הסתכלו דרך עינית המיקרוסקופ וודאו שהזונה פלוצ'ידה של העובר ממוקדת ואור הלייזר LED גלוי.
4. הזיזו את שלב המיקרוסקופ כדי לכוון את הזונה עם נורית ה-LED/לייזר.
5. באמצעות תוכנת המחשב להגדיר לייזר XYClone ל 250 μs.
6. התאם את גודל תאורת ה-LED למידות הרצויות (הגדרה 5 בניסוי זה).
7. לנקב את הזונה של כל ביצה מופרית שלוש פעמים עם הלייזר. ניתן לנקב או לדלל את הזונה. באמצעות ההגדרות לעיל, הלייזר ייצור חור בקוטר של 10 מיקרומטר (איור 1).
   הערה: כיוון קרוב לגוף הקוטב מרחיק את הלייזר מהתא העוברי.
8. לאפשר לביציות מופרות להתאושש במשך שעתיים באינקובטור תרבית הרקמה לפני המעבר לשלב הבא.

2. התמרה של ביציות מופרות בעכבר בעקבות ניקוב לייזר XYClone

1. Pipet 2 μL של lentivirus מרוכז (יותר מ 1e8 TU / mL titer) לתוך 50 μL KSOM טיפה. אין לצנרת למעלה ולמטה. ביצים מופרות נצמדות בקלות לקצה הפיפט. בהתבסס על הניסיון שלנו, יחידות מתמרות 1e5-5e5 של לנטיוירוס בנפח קטן מ-3 μL הן אופטימליות להעברת גנים.
2. לאפשר לביציות מופרות להתפתח לבלסטוציסט במשך 4 ימים באינקובטור. אין צורך לשנות את התקשורת.

3. העברה לא ניתוחית של עוברי עכברים שעברו המרה לעכברות פסאודו-הרות

1. השתמש עכברים pseudopregnant, 3.5 יום לאחר ההזדווגות.
2. השתמש במכשיר Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) כדי להשתיל עוברי עכברים בעכברות פסאודו-הרות.
   1. באמצעות מיקרוסקופ כירורגי או ניתוח, הכנס ספקולום בנרתיק כדי לדמיין את צוואר הרחם.
   2. יש להכניס את המכשיר להחזרת עוברים לא ניתוחית (NSET) כ-5 מ"מ לתוך צוואר הרחם ולהפקיד עוברים בנפח של כ-2 μL.
      הערה: מכשיר NSET סטרילי משמש לכל העברה ומושלך לאחר ההליך. כל הריאגנטים המשמשים למניפולציה של העוברים חייבים להיות סטריליים.
3. העבר 10-15 בלסטוציסטים בריאים בנפח 2 μL של KSOM לכל עכברה פסאודו-הרה.
4. המשך לעקוב ולמדוד את העלייה במשקל בעכברים מדומים בימים הבאים כדי לקבוע אם NSET היה מוצלח.
5. שחזור גורים על ידי מתן אפשרות לעכברות ההרות להמליט באופן טבעי או ביצוע ניתוח קיסרי 17 יום לאחר החזרת העוברים. לעתים קרובות יש צורך בניתוח קיסרי אם קיימים מעט מאוד עוברים והם גדלים גדולים מדי ללידה טבעית.
6. לאסוף רקמות מגורים עבור גנוטיפ כדי לקבוע את קצב transgenesis.

תוצאות

איור 1: טיפול בלייזר בביציות מופרות של עכברים. דוגמאות לניקוב הזונה ליצירת חור לעומת דילול הזונה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פלסמיד CD510B-1	מדעי המערכת	CD510B-1	משמש לאריזת lentivirus המבטא EF1a-copGFP
דימתילפוליסילוקסאן	סיגמא	DMPS5X	גידול עוברים
לייזר XYClone	המילטון ת'ורן ביוסיינסס		ביציות מופרות של עכבר מחורר
מכשיר להעברת עוברים לא ניתוחיים (NSET)	פאראטק	60010	NSET של עוברים
KSOM בינוני	מיליפור	MR-020P-5F	גידול עוברים
הרכב KSOM:			מ"ג/100 מ"ל
NaCl			555
KCl			18.5
KH2PO4			4.75
MgSO4 7H2O			4.95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
גלוקוז			3.6
נא-פירובט			2.2
DL-חומצה לקטית, מלח נתרן			0.174מ"ל
10 מ"מ EDTA			100μL
סטרפטומיצין			5
פניצילין			6.3
0.5% פנול אדום			0.1 מ"ל
ל-גלוטמין			14.6
MEM חומצות אמינו חיוניות			1 מ"ל
MEM AA לא חיוני			0.5 מ"ל
BSA			100