העברת גנים בתיווך ביולוגי: טכניקה להעברת גן מעניין בתאי מטרה באמצעות אקדח גנים ביוליסטי

תקציר

מקור: Taylor, T., et al. Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (2015).

בסרטון זה אנו מדגימים את הפרוטוקול של העברת גנים ביולוגיים בתיווך אקדח בתאים בתרבית. שיטה זו מספקת שיטה פשוטה של טרנספורמציה גנטית יציבה באמצעות כמות מינימלית של DNA.

פרוטוקול

1. הכנת DNA

1. הכינו דיסקים ביוליסטיים כתומים על ידי טבילתם באתנול 100% באמצעות מלקחיים. מניחים את הדיסקיות בכלי פטרי גדול המכיל מייבש לייבוש (יש לוודא שהמייבש אינו נוגע בדיסקיות).
2. לאחר הייבוש, לחץ על דיסקי המקרו-נשא לתוך מחזיקי הדיסקים הכסופים (שקודם לכן ניגבו עם 100% אתנול).
3. מערבולת זהב microcarrier חרוזים מרחפים 100% אתנול aliquot 12 μl לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, צינור אחד לכל טרנספורמציה.
4. הוסף לכל צינור לפי הסדר: 2 מיקרוגרם DNA (רצוי 2 μl של 1 מיקרוגרם / μl של DNA), 10 μl 2.5 M CaCl₂, ו 2 μl 1 M בסיס ללא זרע.
5. הגדר בקרה שלילית כמו בשלב 1.4 אך ללא DNA.
6. מערבבים כל צינור ודגרים בטמפרטורת הסביבה במשך 5 דקות. מעבירים בעדינות כל צינור מדי פעם כדי להשהות מחדש את החרוזים שהתיישבו במהלך הדגירה.
7. סובב צינורות ב 225 x גרם במשך 30 שניות כדי לגלול את חרוזי הזהב מצופים DNA. בזהירות להסיר את supernatant (על ידי pipetting או שאיפה) ולהשליך.
8. יש להשהות מחדש את החרוזים לחלוטין ב-600 מיקרוליטר של אתנול 100% על ידי פיטום איטי למעלה ולמטה.
9. סובב צינורות ב 225 x גרם במשך 30 שניות כדי לגלגל את החרוזים ללא אריזה. בזהירות להסיר ולהשליך את supernatant.
10. השהה מחדש את חרוזי הזהב המצופים ב- DNA ב- 8 μl של אתנול 100% על ידי פיפטציה איטית למעלה ולמטה.
11. פיפטה חרוזי זהב מצופים DNA על מרכז הדיסק הביוליסט בקוטר 1 ס"מ ולאפשר להתייבש.
    הערה: עיגול זהב מיובש הנראה במרכז הדיסק הביוליסטי מצביע על ריכוז מספיק של חרוזי זהב.
    הערה: הדיסקים הנשאים העמוסים בחרוזי זהב מצופים DNA מוכנים כעת לשימוש עם אקדח הגנים.

2. הפעלת אקדח הגנים

1. הפעל את משאבת הוואקום.
2. הפעל את גז ההליום על ידי סיבוב הידית נגד כיוון השעון עד לקבלת לחץ של כ -2,200 psi על מד הלחץ.
3. הפעל את אקדח הגנים על ידי היפוך המתג האדום משמאל.
4. ודא שקצבי הזרימה של השואב והאוורור מותאמים כך שהוואקום יגיע ל -28 אינץ 'כספית תוך 15 שניות.
5. ודא שהמרחק בין דיסק הקרע למקרו-נשא הוא כ -3/8 אינץ '.
6. נקו את כל החדר על ידי ניגוב עם אתנול.
7. השקיעו את דיסקי הקרע באתנול 100%. הניחו לייבוש על משטח סטרילי (למשל, צלחת פטרי).
8. השתמש במפתח מומנט כדי לשחרר את מחזיק דיסק הקרע. הכנס דיסק קרע נקי למחזיק. הברג את מחזיק דיסק הקרע בחזרה למקומו והדק באמצעות מפתח מומנט על ידי סיבובו פעם אחת ימינה.
   הערה: דיסקים של קרע יוחלפו לאחר כל צילום.
9. השקיעו את רשתות הרשת באתנול 100%. הניחו לייבוש על משטח סטרילי (למשל, צלחת פטרי).
10. לאחר הייבוש, הניחו רשת שטופה על לוח ההרכבה מפלסטיק לבן. הנח את צד ה- DNA של מחזיק הדיסק המקרו-נשא כלפי מטה לתוך תא הדיסק. הברג את מכסה הכסף והנח את צלחת ההרכבה בחריץ הגבוה ביותר.
    הערה: מסך הרשת יוחלף לאחר כל צילום.
11. מניחים צלחת אגר YPD המכילה 1 M סורביטול על הצלחת התחתונה.
12. סגרו את דלת התא ונעלו אותה למקומה.
13. דחפו והחזיקו את המתג האדום האמצעי כלפי מעלה כדי להפעיל את השואב ולאפשר לשואב להגיע ל-28 אינץ' כספית. ברגע שמגיעים לרמת ואקום מתאימה, מעבירים את המתג למצב למטה. כאשר אתה מוכן, לחץ על המתג האדום מימין כדי לירות. כאשר דיסק הקרע קופץ, שחרר מיד את לחצן האש ולחץ על המתג האדום האמצעי למצב האמצעי כדי לאוורר את התא ל- 0 psi.
14. נקו את שברי הדיסק וכנתו את אקדח הגנים. לאחר מכן כבה את גז ההליום על ידי סיבוב הידית בכיוון השעון, ולבסוף, כבה את משאבת הוואקום.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חרוזי זהב 0.6 מיקרומטר	ביו-ראד	165-2262	http://www.bio-rad.com
בסיס ללא זרעונים	סיגמא- אולדריץ'	S0266	https://www.sigmaaldrich.com
1350 psi דיסק קרע	ביו-ראד	165-2330	http://www.bio-rad.com
עצירת מסכים	ביו-ראד	165-2336	http://www.bio-rad.com
דיסקים של מקרו-נשאים	ביו-ראד	165-2335	http://www.bio-rad.com
מערכת PDS-1000/He	ביו-ראד	165-2257	http://www.bio-rad.com
מיקרופוגה 18 צנטריפוגה	בקמן קולטר	F241.5P	www.beckmancoulter.com