$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ציפוי כלים פולי-אורניתין/למינין (Po/L)
הערה: הכרכים מותאמים לציפוי צלחת בת 24 בארות.
- במידת הצורך, הכניסו לבאר מכסה סטרילי בקוטר 12 מ"מ.
- מצפים את הבארות עם 500 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל תמיסה Poly-L-Ornithine מומס במים.
- תן הבארות לשקוע בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה.
- יש להסיר את תמיסת Poly-L-Ornithine ולייבש באוויר למשך 30 דקות.
- מצפים את הבארות לילה ב 37 °C עם 500 μL של 3 מיקרוגרם / מ"ל למינין ב bicarbonate L-15.
הערה: בארות ניתן לאחסן ב 37 ° C במשך 7 ימים באינקובטור. עבור דגירות ארוכות, הוספת PBS סטרילי בין הבארות יכולה לעזור למנוע אידוי בינוני.
2. תרבות נוירונים מוטוריים
- לדלל את MNs לצפיפות המתאימה, בדרך כלל 5,000 עד 10,000 תאים ב 500 μL של מדיום תרבית לכל באר בצלחת 24 באר.
הערה: צפיפות הזריעה היא סביב 30,000 ו -1,500 תאים עבור לוחות 6 ו -96 בארות, בהתאמה.
- הסר את תמיסת הלמינין עם P1000.
- העבירו מיד את ה-MNs המדוללים במדיום התרבית לתוך לוחות הציפוי כדי למנוע התייבשות.
- לדגור את התרבות במשך 2 ימים ב 37 °C (77 °F).
3. מגנטופקציה של נוירונים מוטוריים
הערה: בשלבים הבאים, הכמויות המשמשות מיועדות להעברה של באר אחת של צלחת 24 בארות. עיין בפרוטוקול היצרן לקבלת תבנית אחרת.
- להכנת הדנ"א, יש להשהות מחדש 1 מיקרוגרם של דנ"א ב-50 מיקרוליטר של מדיום תרבית עצבית ומערבולת למשך 5 שניות. כאן, 9 kb plasmids עם CAGGS promotor (pCAGEN) שליטה cDNA neurofilament משמשים.
- להכנת צינור חרוזים, להשהות מחדש 1.5 μL של חרוזים ב 50 μL של מדיום התרבות העצבית.
- הוסף את תמיסת החרוזים 50 μL לתמיסת ה- DNA של 50 μL ודגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (נפח כולל = 100 μL).
- במהלך דגירה זו, למשוך 100 μL של מדיום תרבית מן הבאר כי יהיה transfected.
הערה: שים את הלוח המגנטי באינקובטור כדי לחמם אותו ל 37 ° C.
- מעבירים 100 μL מתערובת הדנ"א/חרוזים לבאר, ודגרים על הצלחת 20-30 דקות על הלוח המגנטי ב-37°C.