1. הכן מבנה רטרו-ויראלי
- שיבוט משנה של שרשראות אלפא ובטא של קולטן תאי T (TCR), המופרדות על ידי מקשר 2A, לווקטור רטרו-ויראלי מבוסס MSCV (לדוגמה, pMIAII או pMIGII).
הערה: המקשר 2A מאפשר ביטוי סטויכיומטרי וקונקורדנטי של שרשראות TCR אלפא ובטא ממסגרת קריאה פתוחה אחת. הווקטור כולל קסטת חלבון פלואורסצנטי IRES (ametrine או GFP) המשמשת למעקב אחר תאים מתמרים ויעילות התמירה.
- בודד DNA פלסמיד באמצעות ערכת הכנת פלזמה שהושגה באופן מסחרי או מוצר דומה. יש להשתמש בריכוז עבודה של 1-2 מיקרוגרם μl-1.
2. יצירת קווי תאי יצרן רטרו-ויראליים
- השתמש בתהליך דו-שלבי כדי לייצר את קווי תאי היצרן הרטרו-ויראליים.
- צור רטרו-וירוס על ידי טרנספקציה חולפת של תאי 293T עם שלושה פלסמידים (pVSVG, pEQ-Pam3(-E) ווקטור עניין) וקח את הסופרנאטנט הרטרו-ויראלי מתאי 293T כדי להתמיר את קו תאי היצרן הרטרו-ויראלי הרטרו-ויראלי GP+E86.
- בודד את 40% העליונים של תאי יצרן המבטאים GP+E86 פלואורסצנטיים על ידי FACS והפץ את תאי היצרן המתומרים-GP+E86 כמקור לנגיף.
הערה: הדור של יצרני טיטר גבוה הוא קריטי עבור התמרה יעילה של תאי מח עצם.
3. העברת גנים של תאי גזע בתיווך רטרווירוס (יום -5)
- הפשרה ותרבית 0.5 -1.0 x 106 מכל קו תאי יצרן GP+E86 ב- DMEM מלא 10% (vol/vol) FBS כדי לאפשר צמיחה מספקת לשני לוחות 150 מ"מ מתמזגים עד יום 0 של פרוטוקול זה.
הערה: הפשרת 0.5 - 1.0 x 106 מכל קו תאי יצרן GP+E86 בצלחת של 10 ס"מ תאפשר מפגש של 30 - 50% ביום 5. זה גם מאפשר 5 ימים של תרבית על מנת להרחיב את קווי תאי היצרן GP+E86 לשני לוחות 150 מ"מ מתמזגים עד יום 0.
- קו תאי יצרן רטרו-ויראלי בתרבית במצע תרבית רקמה שלם המכיל 5% סרום עגל עובר, וציפרופלוקסצין (10 מיקרוגרם/מ"ל) למניעת זיהום מיקופלסמה.
הערה: יש להפסיק את השימוש בציפרופלוקסצין בעת יצירת הסופרנאטנט הנגיפי להתמרה של מח עצם. הימנע מצמיחת יתר של קו תאי היצרן, מכיוון שהדבר ישפיע לרעה על יעילות התמרת מח העצם.
4. תרבית תא מפיק רטרו-ויראלי (יום 0)
- צלחת 3 x 106 תאי יצרן רטרו-ויראליים לכל צלחת 150 מ"מ ב 18 מ"ל DMEM מלא 20% (vol/vol) FBS.
- לדגור תאי יצרן רטרו-ויראליים ב 37 ° C במשך הלילה. צפו צלחת אחת בקוטר 150 מ"מ עבור 15 מיליון תאי מח עצם (כ-2-3 עכברים תורמים).
5. סופרנאטנט רטרו-ויראלי (יום 1)
- למחרת (כ-24 שעות מאוחר יותר), קצרו את הסופרנאטנט הרטרו-ויראלי מצלחות היצרן (שהוגדרו בשלב 4) על ידי ציור הסופרנאטנט הרטרו-ויראלי ישירות מהצלחת בקוטר 150 מ"מ עם מזרק של 10 מ"ל ומסנן באמצעות מסנן מזרקים של 0.45 מיקרומטר.
- החלף בזהירות את הסופרנאטנט הרטרו-ויראלי שהוסר ב-18 מ"ל של FBS DMEM 20% (vol/vol) מלא טרי.
- הוסף את הסופרנאטנט הרטרו-ויראלי המסונן עם IL-3 (20 גרם מ"ל-1), IL-6 (50 גרם מ"ל-1), MSCF (50 גרם מ"ל-1) והקסדימתרין ברומיד (פוליברן) (6 מיקרוגרם מ"ל-1).
הערה: Hexadimethrine bromide צריך להיות טרי כל 2 חודשים כדי למנוע ירידה ביעילות של התמרה רטרוויראלית.
6. סופרנאטנט רטרו-ויראלי והתמרה (יום 2)
- לאחר 24 שעות, אספו סופרנאטנט נגיפי טרי מקו תאי היצרן הנגיפי. סננו את הסופרנאטנט הרטרו-ויראלי באמצעות מזרק של 10 מ"ל ומסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר. השלימו את הסופרנאטנט הרטרו-ויראלי המסונן עם IL-3 (20 גרם מ"ל-1), IL-6 (50 גרם מ"ל-1) ו-SCF (50 גרם מ"ל-1), והקסדימתרין ברומיד (6 גרם מ"ל-1).
- לאחר מכן, בזהירות להסיר עם פיפטה או לשאוף את העליון 2 מ"ל של מדיה מכל באר של צלחת שש באר המכיל את תאי מח העצם.
הערה: עבוד בזהירות לא לשאוף את מח העצם, אשר מרוכז בדרך כלל באמצע הבאר. לחלופין, ניתן לסובב את הסופרנאטנט שהוסר למטה כדי לשחזר תאי מח עצם שאבדו.
- לכל באר במח העצם צלחת 6 בארות להוסיף 3 מ"ל של supernatant ויראלי טרי המכיל ציטוקינים ו Hexadimethrine bromide. עטפו את הצלחות בניילון וחזרו על התמרת הסחיטה במהירות של 1,000 x גרם למשך 60 דקות ו-37°C. פתחו את הצלחות ודגרו על תאים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 למשך הלילה (כ-24 שעות).
7. תוספת DMEM טרי (יום 3)
- לאחר 24 שעות, להסיר את 2 מ"ל העליון של מדיה מכל באר של צלחת שש באר המכילה את תאי מח העצם, כמו בשלב 6.2. החלף את המדיה שהוסרה ב- DMEM 20% טרי (vol/vol) FBS בתוספת ריכוזים סופיים של IL-3 (20 גרם ml-1), IL-6 (50 גרם ml-1) ו- SCF (50 גרם ml-1).
- לדגור על לוחות מח עצם ב 37 ° C CO2 אינקובטור עוד 24 שעות.
