שמן אדום O צביעה: טכניקה להכתמת שומנים ניטרליים ב hepatocytes לגילוי סטאטוזיס בכבד במבחנה

תקציר

מקור: Campos-Espinosa, A. et al., מודל של סטאטוזיס ניסיוני במבחנה: תרבית תאי הפטוציטים בתווך מותנה עומס יתר של שומנים. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה, אנו מדגימים צביעה חוץ גופית של שומנים ניטרליים בהפטוציטים כדי לזהות סטאטוזיס בכבד או הצטברות שומן מופרזת בכבד. עודף שומן מצטבר בתאים בצורה של טיפות שומנים. שמן אדום O הוא צבע מסיס שומנים שנקשר לשומנים ניטרליים תוך תאיים בטיפות שומנים אלה. כאשר נצפים תחת מיקרוסקופ אור, טיפות שומנים תוך תאיות אלה מופיעות בצבע אדום עז.

פרוטוקול

1. צביעת שומנים עם שמן אדום O

1. שים כיסוי תרבית תאים בכל באר בצלחת של 24 בארות.
2. זרעו 100,000 תאי HepG2 לכל באר. הוסף 1 מ"ל של RPMI סטנדרטי 1640.
3. יש לדגור מראש בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 למשך 24 שעות.
4. שנה את תקן RPMI 1640 בינוני עבור התווך הסטאטוגני.
5. יש לדגור במשך 24 שעות, יומיים, 3 ימים ו-4 ימים, ולרענן את המדיום הסטטוגני כל 24 שעות.
6. לאחר הזמן המתאים, השליכו את הסופרנטנט.
7. יש לשטוף עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). השליכו את הסופרנטנט.
8. תקן עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde ב PBS.
9. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
10. השליכו את עודף הפרפורמלדהיד.
11. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של מים מזוקקים.
12. מוסיפים 1 מ"ל של 70% איזופרופנול ודגרים במשך 5 דקות.
13. להשליך את עודף של isopropanol. אין צורך בשטיפת PBS בשלב זה.
14. מוסיפים 1 מ"ל של תמיסת O שמן-אדום ודגרים במשך 30 דקות.
15. השליכו את עודפי תמיסת O בצבע אדום-שמן.
16. יש לשטוף עם 1 מ"ל מים מזוקקים.
17. הוסף 500 μL של תמיסת hematoxylin. דוגרים במשך 3 דקות.
18. השליכו את עודף תמיסת המטוקסילין.
19. יש לשטוף עם 1 מ"ל מים מזוקקים.
20. התבוננו תחת המיקרוסקופ בהגדלה של 400x (אובייקטיבי 40x, עיני 10x).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיה תרבותית RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, ארה"ב	31800-022	-
סרום בקר עוברי (FBS)	ThermoFisher-Gibco, ארה"ב	A4766801	-
קו תאי HepG2	ATCC, ארצות הברית	HB-8065	קרצינומה הפטוצלולרית תאים אנושיים.
אינקובטור לח	Thermo Electronic Corporation, ארה"ב	מודל: 3110	טמפרטורה (37 °C ± 1 °C), לחות (90% ± 5%), CO2 (5% ± 1%)
מיקרוסקופ הפוך ליקוי חמה	NIKON, JPN	דגם: TE2000-S	-
איזופרופנול	סיגמא-אולדריץ', ארה"ב	I9030-4L	-
ערכת O אדום שמן	Abcam, ארצות הברית	ab150678	ערכה להדמיה היסטולוגית של שומן נייטרלי.
פרפורמאלדהיד	סיגמא-אולדריץ', ארה"ב	P6148-500G	-
פניצילין/סטרפטומיצין	ThermoFisher-Gibco, ארה"ב	15140-122	אנטיביוטיקה 10,000 U/mL פניצילין, 10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין
פוספט מלח חוצץ	ThermoFisher-Gibco, ארה"ב	10010-023	-
פיפטות סרולוגיות	Sarstedt, AUS	86.1253.001	לא פירוגני, סטרילי, 5 מ"ל
פיפטות סרולוגיות	Sarstedt, AUS	86.1254.001	לא פירוגני, סטרילי, 10 מ"ל
סודיום ביקרבונט	סיגמא-אולדריץ', ארה"ב	S5761-1KG	הכנת מדיה תרבותית
נתרן אולאט	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, ארה"ב	sc-215879A	-
נתרן פלמיטט	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, ארה"ב	SC-215881	-
טריפסין 0.05% /EDTA 0.53 מ"מ	Corning, ארצות הברית	25-052-CL	-
24 אשכול תרביות תאים באר	Corning, ארצות הברית	3524	תחתית שטוחה עם מכסה. תרבית רקמות מטופלת. לא פירוגני, פוליסטירן, סטרילי. 1/חבילה.