כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת ריאגנטים
- בידוד והסתיידות של VSMCs אבי העורקים מורין
- פתרון עיכול אבי העורקים:
- הכינו תמיסה טרייה (~3-5 מ"ל לאבי העורקים שנקטף) עם תמיסת מלח מאוזנת של Hank (HBSS) המכילה 175 U/ml סוג 2 collagenase ו-1.25 U/ml elastase. יש לעקר את התמיסה באמצעות מערכת סינון מונעת ואקום בגודל 0.22 מיקרומטר ולשמור את התמיסה על קרח עד לשימוש.
- מדיה סלולרית:
- תוסף 500 מ"ל של Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) עם 10% סרום בקר עוברי, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין. יש לחמם את המדיה ל-37°C לפני השימוש.
- מדיית הסתיידות:
- מדיית הסתיידות A (NaPhos; משמשת בקווי תאי עכבר):
- תוספת 100-500 מ"ל DMEM (נפח לפי הצורך) עם 10% סרום בקר עוברי, 2 mM נתרן פוספט, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין. יש לחמם את המדיה ל-37°C לפני השימוש.
או
- מדיית הסתיידות B (βGP/Asc/DEX; משמשת בקווי תאים של עכברים או בני אדם):
- תוספת 100-500 מ"ל DMEM (נפח לפי הצורך) עם 10% סרום בקר עוברי, 10 mM β-גליצרופוספט דיסודיום, 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה L-אסקורבית, 10 ננומטר dexamethasone, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין. יש לחמם את המדיה ל-37°C לפני השימוש.
2. נתיחת עכבר
- המתת חסד עכבר עם הזרקת pentobarbital intraperitoneal 200 מ"ג / ק"ג.
- הניחו את השכיבה של בעל החיים על לוח הדיסקציה וייצבו על ידי הצמדת כל כף ללוח. בעזרת מיקרוסקופ מנתח ומספריים קטנים, מבצעים חתך בקו האמצע הנמשך מהבטן התחתונה לבית החזה העליון.
- לקלף בחזרה את העור עם מלקחיים ולהסיר את הצפק, חושף את איברי הבטן. הסר את איברי העיכול, נזהר לא transect אבי העורקים.
- בצע חתך רוחבי בסרעפת הקדמית והמשך את החתך לאורך הבטן. באמצעות מספריים דיסקציה, לשחרר את כלוב הצלעות על ידי חיתוך דרך הצדדים של הצלעות והסרת הרקמה הרכה דבק בחלק העליון של עצם החזה. הסר את כלוב הצלעות, חושף את הריאות.
- השאירו את הלב במקומו בתחילה (כדי לסייע בזיהוי וניתוח אבי העורקים הפרוקסימלי) והסירו בזהירות את הריאות. הסר את בלוטת התימוס, קנה הנשימה והוושט בזהירות, וודא שאבי העורקים נשאר שלם.
- באמצעות מלקחיים דקים ישרים ומספריים לחיתוך מיקרו, הסירו את הרקמה הרכה המקיפה את אבי העורקים מהביפורקציה האיליאק לקשת אבי העורקים, תוך שימת לב קפדנית בעת הסרת השומן הפרי-אבי העורקים (איור 1A). הסירו את שאריות השומן והרקמה הרכה המקיפות את הענפים הגדולים של קשת אבי העורקים (כלומר, עורקים ברכיוצפליים, עורקים קרוטידיים נפוצים ועורקים תת-קלאביים, איור 1B).
הערה: חשוב להסיר את השומן מאבי העורקים מכיוון ששומן יכול להגביר את אות הרקע בעת ביצוע הדמיה פלואורסצנטית.
- הסר את הלב מחלל בית החזה, נתק אותו בזהירות מאבי העורקים הפרוקסימלי והשליך. טרנסקט את אבי העורקים הדיסטלי בביפורקציה האיליאקית. באמצעות מחט אינסולין, הזריקו מי מלח רגילים לאבי העורקים מקשת אבי העורקים כדי לשטוף את תאי הדם שנותרו. נתק את אבי העורקים יחד עם כלי קשת אבי העורקים, להסיר אותו לחלוטין מהגוף.
- הניחו את אבי העורקים בתמיסת מלח רגילה על קרח עד שהוא מוכן להדמיה.
3. בידוד תאי שריר חלק ראשוניים של אבי העורקים האאורטלי
- מניחים את אבי העורקים ב-HBSS קר עד להשלמת הנתיחות. בזהירות לחתוך את כל השומן periaortic שנותרו רקמה רכה, משאיר רק את אבי העורקים.
- תחת מכסה מנוע סטרילי של תרבית רקמה, מעבירים את אבי העורקים לתמיסת עיכול אבי העורקים בצלחות תרבית רקמה בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ. מניחים באינקובטור ב 37 ° C למשך 30 דקות עם נדנוד לסירוגין עדין. לאחר העיכול, אבי העורקים מציגים מראה מתוח או מרופט.
- בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה ומלקחיים סטריליים, הסירו את השכבה החיצונית של אבי העורקים תוך שמירה על שלמות השכבה המדיאלית. טכניקה אחת להסרת האדוונטיה היא לקלף את השכבה החיצונית של אבי העורקים בקצה אחד ולהסיר אותה מהשכבה המדיאלית שמתחתיה כמו גרב שניתן לקלף בחזרה ולהסיר.
- לאחר הסרת שכבת ההרפתקה, הניחו את אבי העורקים הנותר בצלחת תרבית רקמה חדשה עם מדיה של תרבית תאים ואחסנו בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 למשך 2-4 שעות.
- מתחת למכסה מנוע סטרילי ובעזרת מספריים סטריליים של מיקרו-דיסקציה בקוטר 3 מ"מ, חותכים את אבי העורקים לטבעות ברוחב 1-2 מ"מ.
- הניחו את הטבעות הללו בצלחת תרבית רקמות חדשה עם תמיסת עיכול אבי העורקים ודגרו בטמפרטורה של 37°C עם נדנוד עדין לסירוגין למשך 120 דקות. פיפטה את התמיסה למעלה ולמטה מספר פעמים במהלך הדגירה הזו כדי להשהות מחדש תאים.
- הוסף 5 מ"ל של מדיה תרבית תאים חמה לתמיסת העיכול ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את הצינור במשך 5 דקות ב 200 x גרם.
- לשאוף את המדיה ולהשהות תאים בנפח הרצוי של מדיה תרבית תאים (למשל, 5 מ"ל).
- צלחת את כל כמות התאים המבודדים מכל אבי העורקים בבקבוק תרביתתאים 25 ס"מ ולדגור ב 37 ° C עם 5% CO2. להפיץ תאים באמצעות טכניקות סטנדרטיות, כפי שתואר קודם לכן. במהלך 7-10 הימים הראשונים של הדגירה, לשנות את המדיה כל 72-96 שעות. ככל שהתאים מתקרבים למפגש, חדשו את המדיה בתדירות גבוהה יותר (כל 48 שעות).
הערה: זה עשוי לקחת שבועות רבים כדי לגדל כמות מספקת של תאים.
- לאחר מפגש, תאי מעבר עם טריפסין כי הוא מחומם ל 37 °C (77 °F).
- הוסיפו 0.5-1.0 מ"ל טריפסין לכל בקבוק תרבית ודגרו במשך 3-5 דקות; טפחו בעדינות על דופן הבקבוק כל 30-60 שניות לפי הצורך כדי לנתק תאים מפני השטח.
- ברגע שהתאים מתנתקים מתחתית הצלוחית, מוסיפים 10 מ"ל של מדיה תאית לתאים בטריפסין. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות. שאפו את התקשורת ואת הטריפסין מכדורית התא. השהה מחדש את התאים בכמות הרצויה של מדיה תאית טרייה (למשל, 5-10 מ"ל) והעבר לבקבוק חדש (כאשר חלק מהתאים מועברים לשקופית תא).
- במעבר הראשון של תאים, לאשר את השושלת תאי שריר חלק עם טכניקות אימונוציטוכימיה סטנדרטיות, כפי שתואר קודם לכן, באמצעות נוגדן מכוון נגד אקטין שריר α חלק.
4. גרימת הסתיידות של תאי שריר חלק בתרבית
- תאי צלחת המתקבלים מ 3.12 בפורמט 6-well.
הערה: מומלץ להתחיל עם 1 x 105 תאים/באר בנפח כולל של 2.0 מ"ל מדיה סלולרית לכל באר.
- אפשר לתאים לגדול במדיית הסתיידות A או B במשך 7 ימים לפחות בתבנית צלחת של 6 בארות. לדגור על תאים ב 37 ° C עם 5% CO2.
- החלפת מדיה סלולרית כל 48 שעות.
5. הערכת הסתיידות VSMC בשיטת צביעת פון קוסה
הערה: שיטת פון קוסה למדידת הסתיידות מטריצה חוץ-תאית של רקמות או תאים בתרבית מבוססת על החלפת יוני סידן הקשורים לפוספט ביוני כסף. בנוכחות אור ותרכובות אורגניות, יוני הכסף מופחתים ומוצגים ככסף מתכתי. כל כסף unreacted מוסר על ידי טיפול עם thiosulfate נתרן. הפרוטוקול לצביעת פון קוסה הוא כדלקמן:
- שאפו מדיה מלוחות תרבית תאים.
- תקן תאים על ידי הצבתם 1 מ"ל של 10% פורמלין בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
- מוציאים את הפורמלין ושוטפים את התאים הקבועים במים מזוקקים למשך 5 דקות.
- לדגור על תאים ב-1 מ"ל של תמיסת חנקת כסף 5% מתחת לנורה של 60-100 ואט למשך 1-2 שעות.
- שאפו את תמיסת הכסף החנקתי ושטפו במים מזוקקים במשך 5 דקות.
- הסר כסף שלא הגיב על ידי הנחת התאים ב 1 מ"ל של תמיסת 5% נתרן תיוסולפט (w/v) במים מזוקקים למשך 5 דקות.
- יש לשטוף תאים במים מזוקקים במשך 5 דקות. יש לחזור על השטיפה 3x. כתם פון קוסה מוכן להדמיה במיקרוסקופ אור הפוך סטנדרטי.
- שלב אופציונלי: כתם נגדי עם 1 מ"ל של אדום גרעיני מהיר למשך 5 דקות. לאחר מכן יש לבצע שלוש שטיפות עם מים מזוקקים (5 דקות כל אחת).
