$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. פרוטוקול צביעת אאוסין
- כדי לקבע דגימות של רקמות רכות, מלא צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל בתמיסה מקבעת המכילה 9.5 מ"ל של 4% (v/v) תמיסת פורמלדהיד (FA) ו-0.5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית (AA).
הערה: הכינו את תמיסת FA טרייה מתמיסת FA נטולת חומצה 37% המיוצבת עם כ-10% מתנול. דללו עוד יותר את תמיסת ה-FA עם מלח חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco. בחר DPBS ללא סידן ומגנזיום. שמור את פתרון FA מדולל לא יותר מחודש אחד. במהלך החמצה ה- pH של התמיסה המקובעת משתנה מנייטרלי לכ- 3.
זהירות: מכיוון ש-FA הוא איבר חריף רעיל, קורוזיבי ומסרטן, השימוש במכסה אדים הוא חובה ויש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים.
- הוסף את דגימת הרקמה הרכה שזה עתה הוסרה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ומקרר את צינור הצנטריפוגה של 50 מ"ל למשך 24-72 שעות.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
- שטפו את דגימת הרקמה הרכה בתמיסת DPBS למשך שעה אחת.
- כדי להכתים את דגימת הרקמה הרכה המקובעת (למשל, כליה שלמה של עכבר), הניחו את הרקמה הרכה ב-2 מ"ל של תמיסת צביעת eosin Y ודגרו על הדגימה למשך 24 שעות. שמרו את הדגימה על צלחת ניעור אופקית לנדנוד חלק (כ-60 סל"ד) במהלך תהליך הדגירה.
הערה: בתמיסת צביעת eosin Y יש ריכוז של 30% (w/v) במים מזוקקים. בחר את נפח תמיסת הצביעה באופן כזה שהדגימה מכוסה לחלוטין על ידי תמיסת הצביעה ואפשר לדגימה לנוע בחופשיות בתוך מיכל הדגימה. זמן הדגירה עשוי להיות שונה עבור דגימות אחרות ויש להתאים אותו בהתאם.
- לאחר הצביעה, הסר את דגימת הרקמה הרכה בזהירות ממיכל הדגימה.
- בזהירות להסיר עודף של חומר מכתים עם נייר טישו תאית.
- הניחו את דגימת הרקמה הרכה במיכל דגימה חרוטי מעל שלב אדי אתנול לאחסון ושימוש נוסף.
הערה: מיכל הדגימה החרוטי חייב תמיד להכיל כמה טיפות של אתנול 70% (v/v) בתחתית הצינור כדי לשמור על דגימת הרקמה הרכה לחה ולמנוע חפצים.