צביעת H&E של קטעי רקמה משובצים פרפין: טכניקת צביעה דיפרנציאלית להדמיית קטעי רקמת כבד באמצעות שילוב של צבעי המטוקסילין ואוזין

Abstract

מקור: Ellis, J. L et al., ניתוחים היסטולוגיים של פגיעה חריפה בכבד אלכוהולי בדגי זברה. J. Vis. Exp. (2017).

בסרטון זה, אנו מתארים טכניקה של צביעת המטוקסילין ואאוזין של חלקי רקמות משובצים פרפין כדי לחקור את ההיסטולוגיה שלהם. ההליך כולל deparaffinization של הרקמה ואחריו צביעת התאים ברקמה. עם הצביעה, הגרעין נראה כחול מובהק, והחלבונים בציטופלסמה מציגים צבע ורוד.

Protocol

1. הכנת פתרונות צביעה

1. סנן את תמיסת מלאי המטוקסילין של האריס כדי להסיר מוצקים ששקעו.
2. קפלו פילטר קפה לשניים כך שהמסנן ייצור חרוט. פתחו את הלוח הצדדי כך שהנוזל יעבור דרך המסנן, ויאפשר לכלוך.
3. הניחו את המסנן בתוך משפך ואת המשפך לתוך בקבוק מדיה מזכוכית. בהדרגה לשפוך את hematoxylin מלאי דרך filter.
   זהירות: המטוקסילין מסוכן במקרה של מגע עין, בליעה ושאיפה. תמיד ללבוש מעיל מעבדה וכפפות ולטפל בתמיסת המלאי במכסה מנוע כימי.
4. הכינו 0.05% HCl על ידי הוספת 125 μL של 12 N HCl ל-250 מ"ל של ddH₂O.
5. הכינו תערובת תמיסת eosin Y-phloxine B על ידי שילוב של 25 מ"ל של 1% eosin Y (aq), 2.5 מ"ל של 1% פלוקסין B (aq), 195 מ"ל של 95% אתנול ו-1 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית בבקבוק זכוכית. מערבבים היטב על ידי ערבול ומאחסנים ב- RT
   זהירות: Eosin Y מסוכן במקרה של קשר עין, בליעה ושאיפה. תמיד ללבוש מעיל מעבדה וכפפות ולטפל בתמיסת המלאי במכסה מנוע כימי.
6. הכינו אתנול 2% על ידי הוספת 2 מ"ל אלכוהול אתילי טהור ל-98 מ"ל מי ביצה.
   זהירות: אתיל אלכוהול הוא מגרה עיניים. יש ללבוש תמיד ציוד מגן מתאים בעת טיפול באלכוהול אתילי. הוא גם דליק ויש לטפל בו ולאחסן אותו בהתאם.
   הערה: הכינו אתנול 2% טרי בכל פעם לפני ביצוע הטיפול באתנול חריף.

2. המטוקסילין ו Eosin צביעה של קטעי פרפין

1. נטרלו את המגלשות על ידי טבילתן ב-100% קסילן למשך 15 דקות; החליפו אותן ל-100% קסילן טרי למשך 15 דקות נוספות.
2. יש לייבש מחדש את המגלשות על ידי טבילתן בסדרה הבאה של אתנול מדורג עד שהנוזל נוזל בצורה נקייה מהמגלשות. עבור כל תמיסה, יש לטבול 8-10 פעמים, 2 שניות לטבילה: 100% אתנול, 100% אתנול, 95% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול, 50% אתנול, 30% אתנול ומים נטולי יונים.
   הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול כאן, וניתן להשאיר את המגלשות ב- RT במים למשך מספר שעות. במידת הצורך, ניתן לאחסן את המגלשות בטמפרטורה של 4°C במים O/N.
3. מניחים את המגלשות בהמטוקסילין האריס מסונן 100% למשך 4 דקות. מיד להעביר אותם בחזרה למיכל עם מים deionized. להזרים מים נטולי יונים, לפינה האחורית של המיכל, הכי רחוק מהחלקים. רוקנו את המיכל מעת לעת עד שהמים כבר לא סגולים.
   הערה: אל תתנו למים לזרום ישירות על המגלשות, מכיוון שהקטעים עלולים לרדת מהמגלשות.
4. בדוק במהירות את עוצמת המטוקסילין במיקרוסקופ מנתח באמצעות אורות צוואר אווז; אל תאפשר לשקופיות להתייבש. אם הכתם הגיע לעוצמה הרצויה, המשיכו לשלב הבא. אם הצבע אינו כהה מספיק, הניחו את המגלשות ב-100% המטוקסילין למשך דקה אחת וחזרו על שטיפות המים לפני שתבדקו שוב.
   הערה: hematoxylin צריך להיות כהה מספיק, כך הצבע לא הולך לאיבוד במהלך מכתים eosin. עם זאת, אם מכתים hematoxylin נראה cytoplasm, החלקים הם overstained.
5. טבלו את המגלשות פעמיים ב-0.05% HCl והעבירו אותן מיד בחזרה למיכל עם מים נקיים שעברו דה-יוניזציה. רוקנו את המים ומלאו את המיכל במים פעמיים.
6. העבירו את השקופיות לאתנול 95% למשך 30 שניות ולאחר מכן העבירו אותן למיכל חדש עם 95% אתנול למשך 30 שניות.
7. הכניסו את השקופיות לתמיסת Eosin Y-Phloxine B למשך 2 דקות. העבירו את השקופיות בחזרה למיכל האתנול הקודם של 95% ובדקו במהירות את עוצמת הצבע מתחת למיקרוסקופ המנתח. אם הכתמים מספיקים, המשך לשלב הבא. אם לא, חזור לתמיסת האאוזין למשך 30 שניות, בדוק שוב וחזור על הפעולה לפי הצורך.
   הערה: צביעת אאוזין מספקת היא בצבע ורוד בהיר ומופיעה בניגוד מובהק לכתם המטוקסילין. הקפד לנגב כל פתרון מהחלק האחורי של המגלשות בעת בדיקה מתחת למיקרוסקופ, כך שלא נצפה צבע מזויף. מכיוון שאאוזין מורכב מ-95% אתנול, פרקי זמן ממושכים באתנול 95% תוך בדיקת עוצמת הצבע עלולים להשמיט חלק מהצבע.
8. מעבירים את המגלשות ל-100% איזופרופנול למשך 15 שניות. מחליפים באיזופרופנול 100% טרי ומחזירים את המגלשות לאיזופרופנול למשך 15 שניות נוספות. חזור על תהליך זה לקבלת 6 שטיפות איזופרופנול בסך הכל.
   זהירות: איזופרופנול הוא גירוי בעיניים ובדרכי הנשימה. הקפידו תמיד ללבוש ציוד מגן מתאים ולהימנע מהתזה. הוא גם דליק מאוד ויש לאחסן אותו ולטפל בו בהתאם.
   הערה: כדי לחסוך בריאגנטים, יש להשליך רק את שטיפת האיזופרופנול הראשונה (הוורודה ביותר). יש לשמור את חמש תמיסות הכביסה האחרות בבקבוקים ממוספרים 1 עד 5, לשימוש חוזר בכתמים הבאים. בעת שימוש חוזר בשטיפות, יש להתחיל עם הבקבוק שמספרו "1" ולהשליך לאחר השימוש. לאחר לשטוף "2" שימש, לשפוך אותו לתוך בקבוק "1", וכן הלאה. השטיפה הסופית צריכה תמיד להיות איזופרופנול טרי.
9. מקם את השקופיות ב-100% xylenes למשך 3 דקות. הסר שקופית אחת בכל פעם והנח תלוש כיסוי.
   1. הוסף אמצעי הרכבה מספיק כדי לכסות את החלקים ולטבול אותם ב 100% xylene.
      הערה: שלב זה יחליק את פני השטח של מדיום ההרכבה ויסיר את כל הבועות.
   2. החל תלוש כיסוי על החלק התחתון של השקופית.
      הערה: אמצעי ההרכבה אמור למשוך את המגלשה למקומה. אם הכיסוי אינו ישר או מונח לחלוטין, טפחו עליו בעדינות למקומו.
   3. כתם כל אמצעי הרכבה עודף על מגבת נייר עד שנראה רק קו דק. טבלו מגבון טישו לתוך הקסילן ונגבו את החלק האחורי של המגלשה כדי להסיר כל מדיום שטפטף. הניחו את המגלשה שטוחה על משטח יציב אך נייד, כמו חתיכת קרטון. מכסים את כל השקופיות הנותרות באותו אופן. אפשר לקסילן להתאדות במכסה המנוע למשך 10 דקות.
      הערה: כל החומרים המזוהמים בקסילן יש להסיר ולהשליך במיכל אטום במכסה המנוע כדי למנוע בריחת אדים.
10. אפשר למדיום ההרכבה להתקשות ב-RT O/N.

3. הדמיה ואחסון של שקופיות מוכתמות

1. קטעי תמונה במיקרוסקופ הפוך מורכב.
   הערה: ניתן לשמור את המגלשות בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% אתנול (EtOH)	Decon Labs, Inc.	2801	דליק
שקופיות טעונות	פישר סיינטיפיק	12-550-16
מיקרוסקופ מנתח	לייקה ביוסיסטמס	לייקה מז 95
סט כתמים Eosin-Phloxine	היצע למצטרפים חדשים	1082א
אתיל אלכוהול	סיגמא-אולדריץ'	E7023	דליק
האריס המטוקסילין	פולי סיינטיפיק R&D קורפ	S212	מגרה
חומצה הידרוכלורית (HCl)	פישר סיינטיפיק	A144	מגרה
איזופרופנול	היצע למצטרפים חדשים	12094E	דליק
קסילנים	פישר סיינטיפיק	X3S-4	מגרה