צביעת מתילן כחול להערכת היווצרות מושבה גרורתית במבחנה: הליך צביעה להערכת גרורות על ידי כימות תאי סרטן שנקטפו ממודל עכבר סרטני

תקציר

מקור: Nagai-Singer, M. A., et al. שימוש בניתוח תמונה מבוסס מחשב לשיפור כימות גרורות ריאה במודל סרטן השד 4T1. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מתארים את הליך צביעת מתילן כחול כדי לכמת את הנטל הגרורתי על ידי ספירת מושבות מוכתמות המתקבלות על ידי גידול תאים סרטניים שנקצרו מאיברים מרוחקים של מודל עכבר לאחר הזרקה.

פרוטוקול

כל נהלי מודל בעלי החיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים וועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. עיבוד רקמות

NOTE: כל השלבים בסעיף זה צריכים להיעשות באמצעות טכניקה סטרילית.

1. תווית 1 15 מ"ל צינור חרוטי לכל עכבר ולהוסיף 2.5 מ"ל של תערובת collagenase סוג IV ו 30 יחידות של אלסטאז לכל צינור. להכנת תערובת קולגנאז מסוג IV, יש להמיס 2 מ"ג של collagenase מסוג IV לכל מ"ל 1x HBSS ומסנן סטרילי. ניתן לאחסן אותו עד 12 חודשים בטמפרטורה של -20°C ולהפשיר אותו בעת הצורך.
2. העבירו את ריאת העכבר שנקטפה לשנייה, נקייה 1x HBSS היטב עבור הדגימה הזו. מערבלים באמצעות מלקחיים כדי להסיר את שאריות הדם. מעבירים ריאה נקייה לצלחת תרבית רקמה ריקה בקוטר 3.5 ס"מ. טחון ריאות עם מספריים. יש לשטוף צלחת עם 2.5 מ"ל של HBSS 1x, להעביר 1x HBSS וחתיכות ריאות לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל שכבר מכיל קוקטייל collagenase/elastase (5 מ"ל בסך הכל).
3. יש לדגור במשך 75 דקות בטמפרטורה של 4°C. המשיכו לערבב דגימות בזמן זה, לכן הניחו את הצינורות על נדנדה או גלגל מסתובב. במהלך שלב הדגירה הזה, יש לסמן צינורות צנטריפוגות בנפח 50 מ"ל ולוחות תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ לכל עכבר. אם אתם מבצעים דילול, יש לתייג מספיק לוחות תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ לדילול.
   הערה: תייגו את המכסה של לוחות תרבית הרקמה. אם תיוג הלוח עצמו, הכתיבה תפריע לניתוח פיג'י-אימג'י.
4. הבא נפח של כל צינור עד 10 מ"ל בסך הכל עם HBSS אחד. יוצקים את התוכן מעל מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל עבור כל דגימה. השתמש בבוכנה של מזרק 1 מ"ל כדי לטחון בעדינות את הדגימה דרך המסננת כדי לאפשר לתאים נוספים לסנן דרכה.
5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 350 x גרם בטמפרטורת החדר (RT). יש להשליך את הסופרנאטנט ולשטוף את הגלולה עם 10 מ"ל של 1x HBSS. חזור על שלב זה פעמיים.
6. גלולת השעיה ב-10 מ"ל של 60 מיקרומטר 6TG מדיה תרבית מלאה, RPMI או IMDM. דגימות צלחות בצלחות תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ, באמצעות סכימת דילול במידת הצורך. יש לדגור ב-37°C, 5% CO₂ למשך 5 ימים.
   הערה: 1:2, 1:10 ו-1:100 הם דילולים נפוצים שיהיה צורך לקבוע אמפירית בהתבסס על פרמטרים של מחקר.
   זהירות: 6TG רעיל. יש לנקוט משנה זהירות בעת הטיפול ולפעול בהתאם לכל הנחיות הסביבה, הבריאות והבטיחות לסילוק.

2. צביעת צלחות

1. יוצקים את אמצעי התרבות מהצלחות למיכל פסולת מתאים. תקן תאים על ידי הוספת 5 מ"ל מתנול לא מדולל לכל צלחת ודגר במשך 5 דקות ב- RT, תוך הקפדה לערבל מתנול כך שיכסה את הצלחת כולה.
   זהירות: מתנול מסוכן אם הוא נבלע, נשאף, או נמצא על העור. השתמש במכסה אדים לשלב זה.
2. יוצקים מתנול מהצלחות למיכל פסולת מתאים. יש לשטוף את הצלחות ב-5 מ"ל מים מזוקקים בכל צלחת ולשפוך מים למיכל פסולת מתאים. הוסיפו 5 מ"ל של 0.03% מתילן כחול לצלחת ודגרו במשך 5 דקות ב-RT, תוך הקפדה על ערבול תמיסה כחולה מתילן כך שתכסה את הצלחת כולה.
3. יוצקים מתילן כחול למיכל פסולת מתאים. שטפו שוב את הצלחות עם 5 מ"ל מים מזוקקים לצלחת. הפוך את הצלחות וכתם על מגבת נייר כדי להסיר נוזלים עודפים. הניחו את הצלחת על המכסה ותנו לאוויר להתייבש למשך הלילה ב-RT.
   הערה: מושבות גרורתיות יהיו כחולות. לאחר ייבוש הצלחות, ניתן לאחסן אותן ב- RT ללא הגבלת זמן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מתנול	פישר סיינטיפיק	A412SK-4
מתילן כחול	סיגמא-אולדריץ'	03978-250ML
RMPI-1640 בינוני	ATCC	30-2001
נדנדה או גלגל מסתובב	כלשהו	כלשהו
מסנן חד פעמי סטרילי עם קרום PES	תרמופישר סיינטיפיק	568-0010
סוג IV collagenase	סיגמא-אולדריץ'	C5138
פלטות תרבית רקמה בקוטר 3.5 ס"מ	נונקלון	153066
צלחות תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ	פישר סיינטיפיק	08-772-22
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל	פישר סיינטיפיק	14-959-70ג
1X תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS)	תרמו סיינטיפיק	SH3026802
צינור צנטריפוגה 50 מ"ל	פישר סיינטיפיק	14-959-49א
מסננת תאים 70 מיקרומטר	פישר סיינטיפיק	22-363-548
70% אתנול	סיגמא אולדריץ'	E7023	לדלל עד 70% עם מי DI
אינקובטור			צריך להיות מסוגל 5% CO2 ו 37 ° C
מלקחיים	רובוז	RS-8100
צנטריפוגה	כלשהו	כלשהו	צריך להיות מסוגל 125 x גרם ו 300 x גרם
מים מזוקקים	כלשהו	כלשהו
אלסטאז	MP Biomedicals	100617