צביעת תאים: טכניקת מבחנה לזיהוי רמות גליקוגן בתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. PBMC בידוד מדם מלא

הערה: בצע הליך זה בארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקה סטרילית וציוד מעוקר על-ידי היצרן.

1. בזהירות לשפוך 10-15 מ"ל של דם שלם מן heparinized (נוגדי קרישה) צינורות איסוף דם לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל. לשפיכת דם קלה, יש לנגב עם ddH₂O ו-70% EtOH באמצעות רקמת ניקוי.
2. לדלל את הדם בצינור החרוטי ליחס של 1:1 עם מלח חיץ פוספט (PBS 1x) pH 7.4. ודא שהנפח הכולל המרבי אינו עולה על 30 מ"ל.
3. מערבבים בעדינות באמצעות אקדח פיפטה סרולוגי למניעת בועות.
   הערה: אין לערבב על ידי היפוך הצינור כדי למנוע הצטברות דם בפקק וחלחול לאחר מכן במהלך הצנטריפוגה.
4. הוסף 13 מ"ל של Ficoll-paque (ראה טבלת חומרים), לצינור חרוטי חדש בקיבולת 50 מ"ל. שמור את הצינור זקוף בארון התקשורת.
5. באמצעות פיפטה העברה, לקחת דם מדולל, לגעת קצה פיפטה העברה לקיר הפנימי של הצינור ליד החלק העליון. בלחץ איטי ויציב, מעבירים את הדם לאורך הקיר הפנימי של הצינור ויוצרים שכבת דם על גבי שכבת הסוכרוז. בצע שלב זה מספר פעמים עד שכל הדם הועבר.
6. מכסים את הצינור בחוזקה וצנטריפוגות את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ב 700 x גרם ברוטור נדנדה עם תאוצה בינונית מוגדרת ל -5, והאטה מוגדרת לאפס.
7. הוציאו את הצינור באיטיות ומבלי להפריע לשכבות, החזירו אותו לארון הבטיחות הביולוגית.
8. אספו בזהירות את המעיל האפי (שכבה לבנה עכורה דקה), שבה ממוקמים PBMCs, המונחים בין שכבות PBS/פלזמה ופיקול באמצעות פיפטת העברה. הימנעו מאיסוף שכבת סוכרוז ואל תפריעו לשכבת תאי הדם האדומים.
9. מעבירים את המעיל האפי לתוך צינור חרוטי סטרילי חדש בנפח 50 מ"ל. ייתכן שיידרשו מספר פעמים של חזרה על שלב 1.8 כדי לאסוף את כל PBMC.
10. הוסף PBS pH 7.4 לצינור עם PBMC ומלא עד 45 מ"ל. יש לנער היטב את הצינור. אין לערבל.
11. שטיפה 1: צנטריפוגה למשך 15 דקות במהירות של 480 x גרם כאשר התאוצה וההאטה המרביות מוגדרות ל-9. שימו לב להיווצרות גלולה של PBMCs בתחתית הצינור החרוט.
12. יש להשליך את ה-PBS (סופרנטנט) לתוך פלסטיק עם 10 מ"ל אקונומיקה.
13. שחררו את כדורי התא על ידי "מידוף" עדין על משטח לא גולה (כלומר, מדף ריק). אין לערבל.
14. הוסף 25 מ"ל של PBS pH 7.4 טרי לצינור. אם יותר מצינור אחד מעובד, אגדו את הכדוריות יחד בשלב זה.
15. שטיפה 2: צנטריפוגה את הצינור למשך 12 דקות במהירות של 480 x גרם כאשר התאוצה וההאטה המרביות מוגדרות ל-9.
16. השליכו את ה-PBS (סופר-נטנט) לתוך הפלסטיק עם מעט אקונומיקה.
17. "מתלה" בעדינות כנגד משטח לא גולה (כלומר, מדף ריק). אין לערבל.
18. הוסף 25 מ"ל של PBS טרי לצינור.
    1. מוציאים 50 μl מהתאים ומעבירים לצינור מיקרוצנטריפוגה לספירת כדאיות.
    2. הוסיפו כמות שווה (50 מיקרוליטר) של טריפאן כחול (כתם כדאיות) ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב בעדינות.
19. הוציאו 10 μl והעבירו אותו להמוציטומטר כדי לבדוק את הכדאיות של תאים למ"ל. רשום את מספר התאים / מ"ל.
20. הוציאו את כמות התאים הרצויה וצנטריפוגו את הצינור למשך 12 דקות ב 480 x גרם עם תאוצה מקסימלית והאטה מוגדרות ל -9.
21. השליכו את ה-PBS (סופרנטנט) לתוך הכד עם אקונומיקה.
22. "מתלה" בעדינות כנגד משטח לא גולה (כלומר, מדף ריק). הוסף 80 μl של PBS לתוך הצינור.

2. הפיכת PBMC לשקופית

1. הניחו 80 μl של התאים על שקופית מיקרוסקופ. מרחו את הטיפה בעזרת שקופית אחרת או הניחו 2 טיפות של 40 μl כל אחת בשני קצוות השקף.
2. השאירו את המגלשה בארון הבטיחות הביולוגי לייבוש. תייג את השקופית בעיפרון בצד החלבי.

3. תיקון הדוגמאות בשקופיות

1. הכן את הפתרון קיבוע על ידי ערבוב 0.5 מ"ל של 37% פורמלדהיד ל 4.5 מ"ל של 99% אתנול.
2. לאחר ייבוש המגלשות, מוציאים 2 מ"ל מהתמיסה המקובעת הטרייה ויוצקים אותה על המגלשה כך שכל פני השטח של המגלשה מכוסים.
3. השאירו את התמיסה על המגלשה למשך דקה. שטפו את המגלשה במשך דקה במי ברז והניחו לה להתייבש באוויר.

4. ביצוע תמיסת עמילאז לשליטה שלילית

1. קח 0.25 גרם של אבקת עמילאז ולהתמוסס ב 50 מ"ל של מים מזוקקים. יוצקים את הפתרון לתוך נקייה 100 מ"ל.
2. טבלו את המגלשה בכד כך שחצי מהמגלשה תקבל את הטיפול והחצי השני יישאר ללא טיפול, ואז דגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (איור 1C).
3. רשום לעצמך באיזה צד של השקף מקבל את הטיפול בעמילאז. צייר קו בגב השקף המציין את הגבול בין הטיפול לשליטה.
4. שטפו את המגלשות עם ddH₂O כדי להסיר את תמיסת העמילאז והשאירו את המגלשה להתייבש באוויר.

5. ביצוע צביעה והדמיה תקופתית של חומצה שיף (PAS)

הערה: ריאגנטים של PAS רעילים בשאיפה והם קורוזיביים, ולכן יש לבצע את השלבים במנדף כימי, ויש לסלק כראוי את מוצרי הפסולת בהתאם להנחיות המוסדיות.

1. מניחים את המגלשה על משטח שטוח ויוצקים 1.50-2.00 מ"ל של תמיסת חומצה תקופתית על הדגימה. דוגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
2. שוטפים את המגלשות במספר מטענים של מים מזוקקים.
3. יוצקים 1.50-2.00 מ"ל מגיב של שיף על המגלשה ודגרים עליו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
4. שטפו את המגלשה במים מזוקקים למשך 5 דקות והניחו לה להתייבש באוויר.
5. יש למרוח מדיית הרכבה של 10 μl על השקופית ולכסות בשתי כיסויים קטנים, או למרוח 50 μl ולהשתמש בכיסוי אחד גדול.
6. יש למרוח לק שקוף על קצוות הכיסוי, ולתת לו להתייבש למשך הלילה.

6. קבל תמונות באמצעות מיקרוסקופ האור הדו-עיני באמצעות המטרה 100X

איור 1: מתודולוגיה שלב אחר שלב של צביעת PAS ב-PBMC.(A) ראשית, בידוד של PBMC מושג באמצעות שיפוע פיקול, הפאנל השמאלי מראה את ההכנה לפני הצנטריפוגה, הפאנל הימני מראה אותו לאחר צנטריפוגה שבה מעיל באפי המכיל את PBMC נצפה במרכז הצינור. (B) PBMCs מבודדים קבועים על המגלשה באמצעות תמיסת קיבוע פורמלין-אתנול. המגלשה נשטפת בעדינות במים מזוקקים מבקבוק שטיפה מפלסטיק. (C) לאחר מכן מניחים את המגלשה בתוך של 100 מ"ל באמצע הדרך מלאה בתמיסת עמילאז, אשר תמיס גליקוגן. המגלשה נשטפת בעדינות. (D) המגלשה מטופלת בתמיסת חומצה תקופתית, שבה מתרחש חמצון של סוכרים. שקופיות נשטפות בעדינות; פעולה זו תסיר את עודפי החומצה התקופתית ותפסיק את שלב החמצון. (E) כאשר מגיב Schiff מתווסף לשקופיות, הוא יגיב עם אלדהידים שנוצרו במהלך שלב החמצון. מגיב חסר צבע זה יגרום לאחר מכן למוצר מג'נטה אדום עמוק. השקופיות נשטפות בעדינות כדי להסיר את מגיב Schiff העודף.