צביעת קרזיל ויולט של קטעי רקמות: הליך צביעה להדמיית סחוס ועצמות בחלקי עוברים קפואים של עכבר

תקציר

מקור: Wu, Meng, et al., Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Carstage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp.(2019)

סרטון זה מתאר הליך צביעה סגול קרסיל כדי לדמיין עצמות וסחוס במקטעים קורונליים של עוברי עכבר מוקפאים. טכניקת צביעה זו מסייעת להבדיל בין עצמות וסחוס בצבעים שונים מהרקמות הסובבות אותם.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת דגימה למיקרודיסקציה לכידת לייזר

1. הכינו פתרונות לכתמים והתייבשות.
   1. מניחים 45 מ"ל של 80% אתנול בכל אחד משלושה צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל על קרח. תייגו אותם כ- #1, #2 ו- #3. לדלל אתנול עם מים נטולי RNase/DNase.
   2. מניחים 45 מ"ל של 95% אתנול בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל על קרח.
   3. מניחים 45 מ"ל של 100% אתנול בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל על קרח.
   4. מניחים 45 מ"ל קסילן בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל בטמפרטורת החדר.
      אזהרה: יש להשתמש בקסילן במכסה אדים.
2. הפשיר שקופית קרום PEN לזמן קצר על ידי הנחתו על יד כפפה, ולאחר מכן לשטוף פעמיים במשך 30 שניות כל אחד ב 45 מ"ל של 80% אתנול (#1 ו #2) עם תסיסה בצינורות צנטריפוגה 50 מ"ל כדי להסיר את OCT.
   הערה: חשוב להסיר OCT לפני הצביעה, כדי למנוע OCT משוחרר במהלך הצביעה לטשטש את הסעיפים. ניתן להשתמש במלקחיים כדי להקל על הסרת OCT שאינו נשטף על ידי תסיסה.
3. הניחו שקופית על יריעת נייר אלומיניום. פיפטה 0.8 מ"ל של 0.1% סגול קרסיל באתנול 50% על המגלשה וכתם במשך 30 שניות. לשטוף את המגלשה ב 45 מ"ל של 80% אתנול במשך 30 s, ולאחר מכן להתייבש על ידי מעבר במשך 30 s כל אחד דרך 45 מ"ל של 95% אתנול, 100% אתנול, וקסילן בצינורות צנטריפוגות 50 מ"ל.
4. עמדו על מגב משימה עדין במשך 5 דקות כדי לנקז קסילן וחלקים יבשים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינור צנטריפוגה	תרמופישר סיינטיפיק	339653	צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים, 50 מ"ל
אצטט סגול קרסיל	סיגמא-אולדריץ'	C5042
מגב משימות עדין	תרמופישר סיינטיפיק	06-666
מים מזוקקים	Invitrogen	10977-015	ללא DNase/RNase
אתנול, מוחלט (200 הוכחות)	תרמופישר סיינטיפיק	BP2818	כיתה ביולוגיה מולקולרית
שקופית קרום PEN זכוכית	לייקה מיקרוסיסטמס	11505158
מתחם OCT	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	102094-106
סוכן טיהור RNase	סיגמא-אולדריץ'	₪520	חומר טיהור RNase לניקוי משטחים
קסילן	סיגמא-אולדריץ'	214736