צביעת קריסטל ויולט: טכניקה לדמיין תאים סרטניים עמידים לתרופות באמצעות מבחני היווצרות מושבה

במאמר זה

תקציר

מקור: Mohr, L. et al., Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת כדאיות התא באמצעות הליך צביעה סגול קריסטלי עבור תאים סרטניים עמידים לתרופות כימותרפיות.

פרוטוקול

1. אפיון פונקציונלי של עמידות דוקטקסל נרכשת על ידי בדיקת היווצרות מושבה

הערה: בפרוטוקול זה, עמידות לכימותרפיה הוערכה באמצעות מבחני היווצרות מושבות. ניתן להשתמש בשיטות חלופיות המשמשות להערכת כדאיות התא (כלומר, מבחני MTS) בהתבסס על העדפות החוקרים.

צלחת 2,000 תאים (DU145 או 22Rv1, הן עמידים בפני ההורים והן בפני Docetaxel) לכל באר בצלחות של 6 בארות, תוך שימוש ב- 2 מ"ל מדיה לכל באר.
לאחר 24 שעות, להוסיף ריכוזים הולכים וגדלים של Docetaxel (תאי ההורים: 0.25, 0.5, 1, 2.5 ו 5 ננומטר; תאי DR: 50, 125, 250, 500 ו- 1,000 ננומטר) עבור קווי תאים DU145 ו- 22Rv1. הוסף DMSO רק לבאר אחת וכן בקרה באותו נפח המשמש למינון הגבוה ביותר של Docetaxel.
לאחר 72 שעות, לשאוף תרופה המכילה מדיה ולהוסיף מדיה טרייה ללא Docetaxel.
דגרו על צלחות במשך 1-2 שבועות עד שהמושבות נראות מתחת למיקרוסקופ.
כדי להכתים את המושבות, שטפו אותן בעדינות עם PBS של 2-3 מ"ל ודגרו עליהן בתמיסה סגולה קריסטלית של 2-3 מ"ל (0.1% w/v ב-10% פורמלין) למשך 20 דקות בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה או מכסה אדים.
יש להסיר את תמיסת הצביעה ולשטוף את הצלחות עם 2-3 מ"ל של H₂O, להסיר H₂O ולייבש את הצלחות באוויר.
נתח את התוצאה על ידי הדמיה של הבארות וספירה ידנית של מושבות בעזרת עט סמן (כדי להימנע מספירת אותן מושבות פעמיים) וייצג את אחוז הכדאיות של התא בגרף. צלמו תמונות דיגיטליות של הלוחות לייצוג דמויות (איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

figure-results-1
איור 1: אפיון פונקציונלי ופנוטיפי של מודלים של תאים עמידים לדוקטקסל. בדיקות היווצרות מושבה ייצוגיות של תאים עמידים להורים ולתאים עמידים לדוקטקסל שטופלו בריכוזי Docetaxel שצוינו במשך 72 שעות. אחוז המושבות לכל ריכוז טיפול מיוצג בגרף המצורף. הניסויים הם טריפליקטים והנתונים מייצגים את הממוצע ± SD. פסי קנה מידה = 5 מ"מ.