צביעת כסף פלואורסצנטית: טכניקה להמחשת סך החלבון בג'ל פוליאקרילאמיד

1. הכנת הג'ל

1. בצע SDS-PAGE עם 4% - 12% ג'ל חלבון Bis-Tris (1 מ"מ, 15-well) באמצעות מיכל ג'ל מיני מלא במאגר 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES).
2. יש לדלל את הדגימות בתערובת של מים מזוקקים, מאגר ליתיום דודציל סולפט (LDS) וחומר להפחתת דגימות.
3. טען את הנתיב הראשון עם כמות כפולה של מלאי (10 μL), ואחריו כמות המלאי הרגילה (5 μL) וסדרה של דילולים כפולים של המלאי לאחר מכן (13 דילולים, מ 2x ל 8192x).
4. הפעל את הג'ל במתח קבוע של 200 וולט למשך 30 דקות.

2. קיבוע הג'ל

1. לאחר אלקטרופורזה, יש לטבול את הג'לים בתמיסה של 100 מ"ל של 40% אתנול/10% חומצה אצטית על שייקר אורביטלי ב-50 סל"ד בטמפרטורת החדר פי 2 (כל אחד למשך 30 דקות), או למשך הלילה ב-4°C.
2. שטפו את הג'לים 3 x 10 דקות כל אחד במים טהורים במיוחד במיכל נקי. שלב הכביסה הוא קריטי. אם החומצה מתמיסת הקיבוע אינה מוסרת כראוי בשלב ההתפתחות הפלואורוגני, ה- TPE-4TA העודף יופעל על ידי החומצה ויוביל לפלואורסצנטיות רקע חזקה בג'ל.

3. הכנת תמיסת AgNO₃ והספגת כסף של הג'ל

1. כדי לייצר את תמיסת AgNO₃ (0.0001%) לספיגה, ראשית, יש להמיס 0.01 גרם של AgNO₃ ב-10 מ"ל מים אולטרה-טהורים כדי להכין תמיסת מלאי AgNO₃ של 0.1%. לאחר מכן, הוסף 100 μL של תמיסת המניות AgNO₃ 0.1% לתוך 100 מ"ל של מים טהורים במיוחד כדי להפוך את פתרון העבודה.
   הערה: יש לאחסן את תמיסת AgNO₃ בחושך לפני השימוש.
2. ספוג את הג'ל עם 100 מ"ל של פתרון עבודה כסף במשך 1 שעה על שייקר מסלול ב 50 סל"ד במיכל זכוכית אטום. קריטי לבצע את הספגה הכסופה מתחת למכסה מנוע, מוגן מפני אור עם רדיד אלומיניום.
3. לשטוף את הג'ל עם מים טהורים במיוחד (כ 100 מ"ל) במיכל נקי עבור 2 x 60 s.

4. התפתחות פלואורוגנית של הג'ל

1. כדי להכין את תמיסת מלאי הצבע (0.1 mM), להוסיף 3.0 מ"ג של צבע TPE-4TA ב 50 מ"ל של מים טהורים במיוחד. סוניק את התמיסה במשך כמה דקות והוסף תמיסת NaOH (לדוגמה 1 M) כדי לעזור להמיס את הצבע.
2. בדוק את הפלואורסצנטיות של התמיסה תחת מנורת UV של 365 ננומטר כדי להבטיח שמולקולת הצבע מומסת במלואה. רק פתרונות חלשים או לא פולטים מצביעים על פירוק מלא.
   הערה: הצבע TPE-4TA סונתז בעקבות הפרוטוקול שדווח לאחרונה על ידי Xie et al.פתרון TPE-4TA יציב מאוד וניתן לשמור אותו בחושך במשך חודשים.
3. כדי להכין 100 מ"ל של תמיסת הפיתוח הפלואורוגנית (10 מיקרומטר), הוסף 10 מ"ל של תמיסת מלאי TPE-4TA לתוך 90 מ"ל של מים טהורים במיוחד. בדוק את ה- pH של התמיסה באמצעות מד pH וכוונן אותו ל 7 - 9 באמצעות תמיסת נתרן הידרוקסידי (1 מיקרומטר).
4. מעבירים את הג'ל למיכל נקי וניתן לאטימה עם 100 מ"ל של התמיסה המתפתחת פלואורוגנית. ודא שהג'ל שקוע לחלוטין בתמיסה. אטמו את המיכל. כסו אותו מאור ונערו אותו למשך הלילה על שייקר מסלול ב-50 סל"ד בטמפרטורת החדר. לחלופין, ניתן גם לקצר את שלב הדגירה לכ~2 שעות על ידי חימום מראש של התמיסה המתפתחת AIE ל 80 מעלות צלזיוס להכתמה ולאחר מכן השארתה בטמפרטורת החדר.

5. עיכוב והדמיה

1. מעבירים את הג'ל למיכל נקי ומכתימים אותו ב-100 מ"ל אתנול 10% למשך 30 דקות
   הערה: מים בלבד ניתן להשתמש כדי לשטוף את הג'ל. עם זאת, יעיל יותר בזמן להשתמש בתמיסת אתנול 10% לעיכוב. זה יעזור להפחית את תהליך העיכוב משעות ל -30 דקות.
2. יש לשטוף את הג'ל במים טהורים במיוחד במשך 5 דקות.
3. דמיינו את הג'ל בערוץ 365 ננומטר או בערוץ 302 ננומטר באמצעות מכונת תיעוד ג'ל.