צביעת טיפות שומנים של Oenocytes Drosophila זחל: טכניקה להערכת הצטברות טיפות שומנים במצב רגיל ולחוץ באמצעות צבע מבוסס BODIPY

תקציר

מקור: Wei, C., et al., Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים צביעת טיפות שומנים באואנוציטים של זחלי דרוזופילה - תאים דמויי הפטוציטים - באמצעות צבע פלואורסצנטי ליפופילי מבוסס BODIPY. תאים אלה משמשים כמודל לחקר חילוף החומרים של שומנים במהלך ההתפתחות ובתגובה לעקה סביבתית כגון רעב.

פרוטוקול

1. טיפול ברעב לזחלים

הערה: בזחלי הכוכב השלישי, יש מעט או ללא טיפות שומנים ניתנות לזיהוי באואנוציטים בתנאי הזנה רגילים, אך טיפות שומנים גדולות רבות יכולות להיגרם באואנוציטים בתנאי עקה, כגון רעב. כדי לאמת עוד יותר שיטה זו, יש צורך לטפל בזחלים אלה כדי לגרום biogenesis טיפות שומנים ב oenocytes. כאן, מסלול זמן רעב של 12 שעות, 24 שעות ו -36 שעות נבחר כפרדיגמה. בפרט, תקופה קצרה של רעב (למשל, 3 שעות) מספיקה כדי לגרום טיפות שומנים ניתנות לזיהוי באואנוציטים. משך הרעב עשוי להשתנות בהתאם למטרות ולהגדרות הניסוי הספציפיות.

1. לעשות תאים לטיפולי הרעבה ובקרה.
   1. לתאי טיפול ברעב: מניחים נייר סינון בגודל מתאים בכלי פטרי בקוטר 6 ס"מ ופיפטה 1 מ"ל PBS על נייר המסנן.
   2. לתאי טיפול בקרה: מניחים 5 מ"ל של מזון קמח תירס סטנדרטי של בלומינגטון בצלחת פטרי.
2. השתמשו במרית כדי לחפור בעדינות את שכבת המזון העליונה המכילה זחלים שעדיין מתחפרים במזון והעבירו אותם לצלחת פטרי מלאה ב-5 מ"ל PBS. ערבבו בעדינות את הזחלים ב-PBS כדי להסיר כל זיהום מזון מהזחלים ולהפוך אותו לנקי ככל האפשר.
3. השתמש במברשת צבע קטנה כדי לאסוף 40 זחלי כוכב שלישי באותו גודל משוער. מיין אותם באופן אקראי לתוך תא רעב או בקרה, עם 20 זחלים כל אחד.
4. מקם את התאים באינקובטור ב 25 ° C עם 60% לחות ולאפשר התפתחות במשך 12 שעות, 24 שעות, ו 36 שעות של טיפול.
   הערה: עבור הזחלים בתא הרעב, הוסף 1 מ"ל של PBS כל 12 שעות כדי למנוע התייבשות הזחלים.

2. דיסקציה של Oenocytes

1. השתמש במברשת צבע קטנה כדי לבחור זחלים בגיל המתאים (12 שעות, 24 שעות או 36 שעות לאחר הטיפול), ולאחר מכן העבר אותם לצלחת פטרי חדשה מלאה ב -5 מ"ל של PBS קר כקרח כדי לשטוף.
   הערה: חזור על שלב 2.2 בעת התמודדות עם זחלים בתא ביקורת כדי להסיר כל זיהום מזון.
2. מלאו צלחת דיסקציה ב-PBS קר כקרח והשתמשו במלקחיים כדי להעביר בעדינות זחלים לתוך צלחת הדיסקציה. שים את לוח הדיסקציה מתחת למיקרוסקופ סטריאו עבור שלב הדיסקציה הבא.
   הערה: הטמפרטורה הקרה כקרח תסייע להאט את תנועות הזחלים ותקל על נתיחה.
3. סובבו את הצד הגחוני של הזחלים כלפי מעלה ואת הצד הגבי כלפי מטה והחזיקו בעדינות במקומם באמצעות מלקחיים. הצמידו את הזחלים ללוחית הדיסקציה על ידי הנחת סיכת דיסקציה דרך הלוע בקצה הקדמי וסיכה נוספת דרך הספירקל בקצה האחורי.
   הערה: הצד הגבי מזוהה בקלות רבה ביותר על ידי נוכחות של הגזעים הגביים של קנה הנשימה.
4. השתמשו במספריים קפיציים של Vannas כדי לחדור (לאורך) דרך האפידרמיס מהקצה הקדמי לקצה האחורי.
5. הסר את הרקמה הפנימית של האפידרמיס באמצעות מלקחיים.
   הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת הסרת ענפי קנה הנשימה כדי למנוע נזק לאואנוציטים, אשר ממוקמים במשטח הפנימי של האפידרמיס.
6. בעזרת מלקחיים, שלפו את סיכות הדיסקציה והעבירו את האפידרמיס לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המלא ב-PBS על קרח.
7. המשך לנתח זחלים אחרים בעקבות ההליך המתואר לעיל.

3. צביעת טיפות שומנים

1. דגרו על האפידרמיס המנותח במאגר הקיבוע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על מסובב.
   הערה: מאגר הקיבוע מכיל 4% פרפורמאלדהיד (PFA) ב-PBS.
2. הסר את מאגר הקיבוע, ולאחר מכן שטיפה מהירה. כדי לבצע שטיפה מהירה, הוסף 1 מ"ל של PBS ב- RT לצינור לאחר הסרת PFA, השהה מחדש בעדינות את הרקמות, והשלך את PBS.
   זהירות: מאגר הקיבוע מכיל PFA, המזיק לבריאות האדם. חשוב להשליך כראוי את חיץ הקיבוע כפסולת מסוכנת.
3. שטפו את הדגימות 3x במשך 5 דקות כל אחת עם PBS כדי לשטוף את כל שאריות ה- PFA האפשריות.
4. דגרו על האפידרמיס עם BODIPY 493/503 (1 מיקרוגרם/מ"ל; ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות ב-RT על מסובב.
   הערה: משלב זה ואילך, עטפו את צינור המיקרוצנטריפוגה בחתיכת רדיד אלומיניום כדי להגן על הדגימות מפני אור ולמזער את הלבנה האפשרית של הצילום.
5. הסירו את תמיסת הצביעה BODIPY 493/503 ושטפו את הדגימות 3x למשך 10 דקות כל אחת עם PBS כדי להסיר לחלוטין שאריות צבע.

4. הרכבה והדמיה

1. מניחים 6 μL של אמצעי הרכבה על שקופית מיקרוסקופ נקי.
   הערה: אמצעי הרכבה משמש לזמן זיהוי ארוך יותר בהתבסס על תכונות האנטי-דהייה שלו.
2. השתמש במלקחיים כדי להרים אפידרמיס אחד ולהסיר בעדינות את שאריות PBS עם מגבון.
3. מקם את האפידרמיס בתווך ההרכבה וכוונן את כיוונו כך שהמשטח הפנימי שלו המכיל את האואנוציטים נמצא בתחתית והמשטח החיצוני שלו נמצא למעלה.
4. מניחים בעדינות מכסה על האפידרמיס.
   הערה: יש להסיר את אמצעי ההרכבה הנוסף שדלף מתחת למכסה בעזרת מגבון, במידת הצורך. כדי להקל על ההדמיה, לדחוף בעדינות למטה על הכיסוי עם מלקחיים, כך שכאשר מתבוננים בשקופית דרך המיקרוסקופ, ניתן לצלם בקלות את אשכול האואנוציטים במישור אחד בודד. לחלופין, זה מעשי לחתוך את האפידרמיס לשני אפידרמיס למחצה דרך קו האמצע כדי למנוע גלגול של האפידרמיס כולו בעת הרכבת הרקמות.
5. יש למרוח לק שקוף סביב קצוות הכיסוי כדי לאטום.
6. שים את המגלשות בקופסת דוגמאות חסינת אור ואפשר ללק להתייבש ב- RT, מה שעשוי לקחת 5-10 דקות.
7. המשך בניתוח מיקרוסקופי. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (הגדלה של 63x עם הגדרות מסנן GFP או FITC ממוטבות, עירור = 488 ננומטר, פליטה = 503 ננומטר) כדי לקבל אותות נקיים ורגישים עם רקע ממוזער.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינור צנטריפוגה 50 מ"ל	קורנינג	430829	50 מ"ל
צלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ	תרמו פישר	150326	6 ס"מ
אגר			למזון זבובים
רדיד אלומיניום	לא ישים	לא ישים	הגנה על השפכטל מפני אור
בודיפי 493/503	Invitrogen	D3922	צבע מכתים טיפות שומנים
מיקרוסקופ קונפוקלי	לייקה	Leica TSC SP5	הדמיה קונפוקלית
סירופ תירס			למזון זבובים
קמח תירס			למזון זבובים
קוורסליפ	סיטוגלאס	10212424ג	20 × 20 מ"מ, 0.13-0.17 עובי
סיכת דיסקציה	לא ישים	לא ישים
צלחת דיסקציה	לא ישים	לא ישים
נייר סינון	לא ישים	לא ישים	קוטר: 11 ס"מ
מאגר קיבוע	לא ישים	לא ישים	4% Paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS
Forcep	דומונט	11252-30	#5
אינקובטור	ג'יאנגנאן	SPX-380	לתרבות זבובים
צינור מיקרוצנטריפוגה	אקסיגן	MCT-150-C	1.5 מ"ל
שקופית מיקרוסקופיה	סיטוגלאס	10127105P-G
אמצעי הרכבה	VECTASHIELDAntifade Mounting בינוני	H-1000	אמצעי הרכבה נגד דהייה
לק	PanEra	AAPR419	אטמו את תלוש הכיסוי
מכחול	לא ישים	לא ישים
PBS	לא ישים	לא ישים	1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na_{2} HPO_{4} ,1.8 mM KH_{2} PO_{4} , pH 7.4)
מסובב	מכשירי מעבדה Kylin-Bell	WH-986
מספריים	סמארטדאטה מדיקל	SR81	מספריים קפיציים של Vannas
קמח סויה			למזון זבובים
מרית	לא ישים	לא ישים
מזון קמח תירס סטנדרטי	לא ישים	לא ישים	מתאים לתקן בלומינגטון < br / > מתכון מזון קמח תירס
מיקרוסקופ סטריאו	לייקה	Leica S6E	לדיסקציה של רקמות
ניגוב נייר	לא ישים	לא ישים
שמרים			למזון זבובים