מאמר שיטה

צביעת hFTAA של משקעי עמילואיד: טכניקה להמחשת סיבי עמילואיד באמצעות צבע מבוסס אוליגותיופן להדמיית פלואורסצנטיות במקטעי רקמות

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Nyström, S. et al., Imaging רקמות עמילואידיות מוכתמות באוליגיותיופנים מצומדים זוהרים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי היפרספקטרלי והדמיית חיים פלואורסצנטית. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר טכניקה להכתמת עמילואידים במקטעי רקמה באמצעות צבע אוליגוטיופן מצומד זוהר - חומצה אצטית הפטמר-פורמיל תיופן, או hFTAA - להדמיית פלואורסצנטיות. עמילואידים הם אגרגטים של חלבונים חריגים עשירים ב-β יריעות. הזיהוי שלהם בדגימות רקמה מועיל באבחון וטיפול במחלות הקשורות לעמילואידים או פרוטאינופתיה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פתרון צביעה LCO

הערה: אם hFTAA נרכש מספק מסחרי, פעל בהתאם להוראות הספק במקום סעיף 1.

  1. השהה מחדש את hFTAA lyophilized ב 2 mM NaOH כדי להכין תמיסת מלאי של 1 מ"ג / מ"ל. שמור את המלאי בבקבוקון זכוכית ב 4 ° C. ניתן לאחסן את המלאי למשך שנה.
  2. ביום הצביעה, הכינו פתרון עבודה על ידי דילול המלאי בקנ"מ 1:10,000 במי מלח חוצצי פוספט (PBS).

2. הכנת דגימות רקמה

הערה: ניתן לצלם סוגי רקמות רבים באמצעות hFTAA כסמן עמילואיד. ראו איור 1 לדוגמה. hFTAA רגיש לקונפורמציה מצטברת. לכן עדיף לבצע את הצביעה על אגרגטים ללא הפרעה וללא חשיפה לאפיטופ. איכות ספקטרלית אופטימלית מושגת אם קיבוע הרקמה נשמר למינימום. לפיכך עדיף חומר קפוא טרי, המקובע בעדינות באתנול בזמן הצביעה. עם זאת, ניתן לזהות משקעי עמילואיד גם ברקמה שהתקבעה עם למשל פורמלין. hFTAA בדרך כלל חודר היטב לרקמה. בחר עובי דגימה התואם לטכניקת ההדמיה המיועדת.

  1. אם פורמלין קבוע, חלקים משובצים פרפין משמשים, deparaffinized ב xylene בן לילה. טבלו את החלקים באמבטיות רצופות של 99% אתנול, 70% אתנול, dH2O ו-PBS, 10 דקות בכל אחת. הניחו לחלקי הרקמה להתייבש בתנאי הסביבה. זהירות: קסילן מטופל תמיד במכסה אדים כימי. קסילן וממיסים אורגניים אחרים מזיקים.
    1. הפשירו קריוסקציות בטמפרטורת החדר. תקנו את חלקי הרקמה ב-10% פורמלין למשך הלילה והחזירו נוזלים על ידי טבילתם באמבטיות רצופות של 99% אתנול, 70% אתנול, dH2O ו-PBS, 10 דקות בכל אחת. הניחו לחלקי הרקמה להתייבש בתנאי הסביבה.
  2. הוסף טיפות של תמיסת העבודה hFTAA (כ- 200 μL) לחלקי הרקמה כדי לכסות אותה. הטיפה צריכה להישאר במקומה על ידי מתח פני השטח. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר להכתמה.
  3. שטפו את תמיסת הצביעה עם PBS של 500 מיקרוליטר באמצעות פיפטה ולאחר מכן טבלו את המגלשה באמבט PBS למשך 10 דקות. הניחו לחלק להתייבש בתנאי הסביבה.
  4. הר באמצעות אמצעי הרכבה פלואורסצנטי. אפשר לאמצעי ההרכבה לשקוע למשך הלילה.
    הערה: צביעת hFTAA יכולה להתבצע בשילוב עם שיטות צביעה אחרות כגון immunofluorescence, סמנים ספציפיים לתאים או אברונים וכו '. כדי לבצע צביעה משותפת, הפעל את פרוטוקול הצביעה המלא שבחרת והוסף צביעת hFTAA בסוף, החל משלב 2.2. ראו איור 2 לקבלת דוגמאות. עבור immunofluorescence, עדיף לבחור נוגדן משני כי הוא נרגש ב 640 ננומטר ומעלה. בתחום אורכי גל זה, hFTAA אינו בולע ולכן אינו יכול להתרגש ולא יהיה פלואורס. זה מבטיח שלא ייראה דימום בין hFTAA לנוגדן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: סוגי רקמות שונים וצברי חלבונים המראים צביעת h-FTAA של: (א) גופי מלורי-דנק המורכבים מצברי קרטין בכבד (מוכתמים ב-DAPI), (ב) תכלילי r חיוביים p62 ברקמת שריר מיוזיטיס ספורדית של גוף הכללה (s-IBM), (ג) עמילואיד של פוליפפטיד עמילואיד איון בלבלב אנושי, (ד) עמילואיד של שרשרת אור אימונוגלובולין במעי האדם, (e) שריטות כבשים (פריונים) במוח עכבר, (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
hFTAA/Amytracker545 אבה ביוטק
מדיום הרכבה פלואורסצנטי Dakoטכנולוגיות Agilent GM304
LeicaDM6000 לייקה
לומן 200 לפני
מערכת Spectraview הדמיה ספקטרלית ASI

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PBS

מאמרים קשורים