צביעת פוספטאז חומצה עמידה לטרטרט: טכניקה במבחנה לזיהוי אוסטאוקלסטים בתרבית המכילים אנזים TRAP

תקציר

מקור: Dai, Q., et al. A בדיקת תרבית אוסטאוקלסטים מבוססת RANKL של מח עצם עכבר כדי לחקור את התפקיד של mTORC1 בהיווצרות אוסטאוקלסט. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את טכניקת צביעת חומצה פוספטאז עמידה לטרטרט כדי לזהות נוכחות של גרגירים המכילים TRAP בתוך אוסטאוקלסטים. הטכניקה יוצרת משקעי גרגרי צבע בצבע מגנטה בציטופלסמה של אוסטאוקלסטים, והופכת אותם לגלויים תחת מיקרוסקופ הפוך.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנה

1. יצירת עכברי מחיקת Raptor ספציפיים לאוסטאוקלסט (Raptor^fl/fl; Ctsk-cre, להלן Rap^Ctsk) על ידי הזדווגות עכברי Raptor^fl/fl עם עכברי Ctsk-cre. השתמש בעכברי ^{Raptor fl/fl} כבקרת WT במחקר זה.
2. יש מיכל עם קרח כדי לשמור על עצם מבודדת.
3. הכינו מדיום תרבות.
   1. הכינו מדיום תרבית α-MEM על ידי תוספת אלפא בינונית חיונית מינימלית (α-MEM) עם 1x גלוטמין, פניצילין-סטרפטומיצין וסרום עגל עוברי 10%.
   2. הכינו מדיום השראת מקרופאגים של מח עצם המורכב מ-50 מ"ל של מדיום α-MEM ו-M-CSF ב-20 ננוגרם/מ"ל.
   3. הכינו מדיום אינדוקציה אוסטאוקלסט המורכב מ-M-CSF ו-RANKL ב-20 ננוגרם/מ"ל, בהתאמה, ב-50 מ"ל של מדיום α-MEM.
4. הכינו את המאגרים הבאים לפני צביעת TRAP.
   1. הכן תמיסת תיקון המורכבת מ 6.5 מ"ל של אצטון, 2.5 מ"ל של תמיסת ציטראט ו 0.8 מ"ל של 37% (vol/vol) תמיסת פורמלדהיד.
   2. הכינו תמיסת צביעת TRAP.
      1. מים דה-יוניים חמים מראש ל 37 °C (75 °F).
      2. הוסף 100 μL של תמיסת בסיס GBC מהירה של גארנט ו- 100 μL של תמיסת נתרן ניטריט למיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל וערבב בהיפוך עדין במשך 30 שניות. השאירו את התערובת לעמוד למשך 2 דקות.
      3. חימום מראש של 9 מ"ל מים נטולי יונים, עד 37°C. הוסף 200 μL של תמיסת בסיס GBC מהירה של גארנט דיאזוטי משלב 1.4.2.2, 100 μL של תמיסת פוספט AS-BI naphthol, 400 μL של תמיסת אצטט ו- 200 μL של תמיסת טרטרט.
      4. יש לשמור את תמיסת תערובת הכתמים TRAP באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.

2. דיסקציה (יום-1)

1. הרדימו 3 עכברי WT ^{ו-Rap Ctsk} נקבות בנות חודש על ידי CO₂ בנפרד. בצע שאיפת CO₂ עם ציוד מתאים על ידי צוות מיומן.
2. יש לטבול 6 עכברים בכד עם 100 מ"ל אתנול 75% (vol/vol) למשך 5 דקות כדי למנוע זיהום חיידקי ולאחר מכן להניח על לוח דיסקציה במצב שכיבה. בצע חתך ב distal של השוקה אנכית לנתח את העור לאורך הגפה האחורית עם מספריים אופתלמיים.
3. חותכים את הרצועה המפרקית של מפרק הירך במספריים ומנתקים את הגפיים האחוריות מתא המטען.
4. חותכים את הרצועה המפרקית של מפרק הברך ומנתקים בזהירות את השוקה ועצם הירך ממפרק הברך. מוציאים בעדינות את הרקמה הרכה בעזרת מספריים.
5. מניחים את כל העצמות של גנוטיפ אחד בתוך עכבר אחד בכל באר של צלחת שש בארות עם 2 מ"ל של α-MEM על קרח.
   הערה: כדי לשמר את יכולת הקיום של התא, העצם צריכה להישמר בתנאים אלה פחות משעה אחת.

3. בידוד (יום-1)

1. מלא באר אחת של צלחת שש בארות עם 75% אתנול (3 מ"ל) ואת 5 בארות אחרות עם α-MEM בינוני (3 מ"ל).
2. שים את כל העצמות של גנוטיפ אחד באתנול לשטוף במשך 15 שניות ולשטוף עצמות 5 פעמים עם מדיום α-MEM במשך 10 שניות בכל פעם.
3. חותכים את האפיפיזה עם המספריים ומחדירים מחט מזרק בקוטר 0.45 מ"מ לחלל העצם ומוציאים מח מוח עם מדיום α-MEM לתוך צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל.
4. יש לשטוף את חלל העצם באותה שיטה מהקצה השני של העצם. חזור על הפעולה לפחות פעמיים כדי לשטוף היטב את חלל העצם עד שהעצם חיוורת.
5. צנטריפוגה את מח העצם כדי לקבל גלולת תא ב 800 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות. שאפו את supernatant.
6. הוסף 3 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים לתוך צינור הצנטריפוגה פיפטה בעדינות כדי להשעות מחדש את מח העצם. שמור את צינור הצנטריפוגה על קרח במשך 8 דקות כדי ליזה תאי דם אדומים.
7. הוסף 6 מ"ל של תווך α-MEM לצינור הצנטריפוגה כדי לעצור את ליזה התא. צנטריפוגה ב 500 x גרם ו 4 ° C במשך 10 דקות ולשאוף את supernatant.
8. יש להשהות מחדש ב-3 מ"ל של מדיום תרבית α-MEM ולמקם את התאים בצלחת בעלת שש בארות (בדרך כלל עכבר אחד לכל באר).
9. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5% CO₂ למשך הלילה.

4. ציפוי (יום 0)

1. העבירו את הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל כדי לאסוף את התאים הלא מחוברים למחרת בבוקר.
2. צנטריפוגה ב 800 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות ולשאוף את supernatant.
3. השהיה מחדש ב-4 מ"ל של מדיום תרבית α-MEM.
4. קח 20 μL של תמיסת התא ולערבב עם 20 μL של Trypan כחול. הוסף 10 μL של התערובת לתא הספירה ולקבל את ספירת התאים לכל מ"ל של תמיסה.
5. הוסף נפח מתאים של מדיום תרבית α-MEM כדי לקבל תמיסה תאית של 500,000 תאים/מ"ל.
6. הוסף 500 μL ו- 50 μL של מדיום השראת מקרופאגים של מח עצם לכל באר של צלחת 24 בארות וצלחת 96 בארות, בהתאמה.
7. הוסף 500 μL ו- 50 μL של תמיסת תאים לכל באר של צלחת 24 באר וצלחת 96 בארות, בהתאמה.
8. דגירה ב 37 ° C באינקובטור 5% CO₂ במשך 3 ימים.

5. בידול (ימים 3-7)

1. שלושה ימים לאחר הציפוי, לאסוף 50 μL בינוני מכל באר של צלחת 96-באר ולהקפיא ב -20 ° C, ולאחר מכן לשאוף את התווך השיורי
.
2. הוסף 1 מ"ל ו 100 μL אוסטאוקלסט אינדוקציה בינוני לתוך כל באר של צלחת 24 באר צלחת 96 באר, בהתאמה.
3. לדגור ב 37 ° C במשך 2 ימים.
4. לאסוף 50 μL של מדיום מכל באר ולשאוף את התווך השיורי.
5. הוסיפו מדיום אינדוקציה אוסטאוקלסטים לכל באר.
6. דגירה ב 37 °C למשך יום אחד.
   הערה: בנקודת הזמן הזו יש לראות אוסטאוקלסטים גדולים ומרובי גרעינים תחת מיקרוסקופ הפוך (איור 1A).
7. אם לא רואים אוסטאוקלסטים, שנו את מדיום השראת האוסטאוקלסטים והתבוננו מדי יום עד שיראו אוסטאוקלסטים.
8. אספו 50 מיקרוליטר של מדיום מכל באר של צלחת 96 בארות לאחר שנוצרו אוסטאוקלסטים.

6. צביעת פוספטאז חומצה עמידה לטרטרט (TRAP)

הערה: אוסטאוקלסטים בוגרים עשויים להיות נוכחים לאחר 6-7 ימים של תרבית חוץ גופית (שלב 4).

1. יש לשאוף בינוני ולשטוף בעדינות 3 פעמים עם PBS אחד.
2. תקן את התאים בכל באר של צלחת 96 באר עם 100 μL של פתרון לתקן עבור 30 s בטמפרטורת החדר.
3. לאחר הקיבוע, יש לשאוף את תמיסת התיקון ולשטוף בעדינות 3 פעמים במים נטולי יונים, שחוממו מראש ל-37°C. יש לשאוף מים נטולי יונים.
4. הוסיפו 100 μL של כתם TRAP לכל באר של צלחת 96 בארות והניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות והגנו מפני אור.
5. לאחר הצביעה, יש לשאוף את כתם ה-TRAP ולשטוף בעדינות 3 פעמים במים נטולי יונים.
6. תמונה אוסטאוקלסטים באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 40.

תוצאות

איור 1: תצוגה מייצגת של אוסטאוקלסטים.(A) אוסטאוקלסטים ענקיים שנצפו בשדה בהיר ביום ה-6. הקו האדום התווה את גבול האוסטאוקלסטים. (B) אוסטאוקלסט ענק, רב-גרעיני, TRAP חיובי (יין אדום) טיפוסי. החץ השחור הצביע על שני גרעינים של האוסטאוקלסט הרב-גרעיני.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכברי Raptorfl/fl	מעבדת ג'קסון	13188
עכברי Ctsk-cre			מתנה מס. קאטו, אוניברסיטת טוקיו, טוקיו, יפן
α-MEM	קורנינג	10-022-CVR
גלוטמין	גיביקו	25030081
פניצילין סטרפטומיצין	גיביקו	15140122
נסיוב עגל עוברי	ביואינד	04-001-1א
עכבר רקומביננטי חלבון M-CSF	מו"פ	Q3U4F9
עכבר רקומביננטי חלבון RANKL	מו"פ	רבע 3TWY5
חיץ ליזיס RBC	ביוטיים	C3702
כחול טריפאן	סיגמא-אולדריץ'	302643
אצטון	שנגחאי כימית ושות' בע מ
תמיסת ציטראט	סיגמא-אולדריץ'	915
תמיסת פורמלדהיד	שנגחאי כימית ושות' בע מ
חומצה פוספטאז, ערכת לויקוציטים (TRAP)	סיגמא-אולדריץ'	387A-1KT
פתרון Garnet GBC Base מהיר	סיגמא-אולדריץ'	3872
תמיסת נתרן ניטריט	סיגמא-אולדריץ'	914
פתרון נפתול AS-BI פוספט	סיגמא-אולדריץ'	3871
תמיסת אצטט	סיגמא-אולדריץ'	3863
תמיסת טרטרט	סיגמא-אולדריץ'	3873
מלח חוצץ פוספט של Dulbecco	קורנינג	21-031-CVR
37% פורמלדהיד	שילונג מדעי
IX71	אולימפוס
מזרק 0.45 מ"מ
מספריים
מלקחיים נגד יתושים