צביעה אדומה של אליזרין: טכניקה לדמיין מינרליזציה על ידי אוסטאובלסטים בתרבית

תקציר

מקור: Kampleitner, C., et al. פרופיל תאימות ביולוגית על ביו-חומרים להתחדשות עצם. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים טכניקת צביעה לזיהוי מידת מינרליזציה או שקיעת סידן באוסטאובלסטים ראשוניים בתרבית באמצעות צבע אדום אליזרין.

פרוטוקול

1. מינרליזציה של אוסטאובלסט (OB) מוערכת על ידי צביעה עם Alizarin Red S (ARS)

1. הוסף אוסטאובלסטים ראשוניים (OBs) לדיסקים β-טריקלציום פוספט (β-TCP) המשמשים כפיגום תואם ביולוגית בצלחת תרבית.
2. שאפו את מדיום התרבית מהבארות המכילות OBs ראשוניים 14 יום לאחר הוספת מדיום המינרליזציה ושטפו פעמיים עם 0.5 מ"ל של 1x PBS ב- RT. שאפו את PBS וקבעו את התאים על ידי הוספת 0.5 מ"ל של תמיסת פורמלין חוצצת 10% ב- RT למשך 10 דקות.
3. שאפו את הפורמלין החוצץ 10% עם צינור חד פעמי ושטפו פעמיים עם 0.5 מ"ל מים טהורים במיוחד.
4. ל-OBs הקבועים, הוסיפו 0.25 מ"ל של תמיסת צביעת ARS של 40 mM (pH 4.2) מומסת במים אולטרה-טהורים ודגרו על הצלחת ב-RT למשך 10 דקות על שייקר ב-100 שייקים לדקה.
5. שאפו את תמיסת הצביעה עם צינור חד פעמי ושטפו עם 1 מ"ל מים טהורים במיוחד. חזור על שלב זה 5-10 פעמים כדי להסיר כתמים לא ספציפיים.
   הערה: פתרון השטיפה צריך להיות ללא צבע.
6. שאפו את המים האולטרה-טהורים והוסיפו 1 מ"ל של PBS קר. דוגרים על הצלחת ב-RT במשך 10 דקות על שייקר ב-100 שייקים לדקה.
7. שאפו את ה-PBS, העבירו את דיסקי ה-β-TCP המוכתמים לבאר חדשה, וסרקו את הלוחות באמצעות סורק שטוח כדי להקליט מינרליזציה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דיסקים β-טריקלציום פוספט (β-TCP, 14 מ"מ)			דיסקים היו מסונטרים בכבשן עמום בטמפרטורה של 1150 מעלות צלזיוס. תיאור מפורט של ההפקה ניתן למצוא בצימר ואח' (doi: 10.1002/jbm.a.34639). הדגימות היו מוקרנות UV (15 דקות לכל צד) לפני השימוש בתרביות תאים.
קצף Orthovita Vitoss (קצף β-TCP/C)	אורתוביטה	2102-1405
אליזרין אדום S	סיגמא-אולדריץ'	A5533
תמיסת פורמלין ניטרלי חוצץ 10%	סיגמא-אולדריץ'	HT501128
מדיום מינרליזציה אוסטאוגנית (MM)			α-MEM + 10% FBS מומת חום + 1% פניצילין-סטרפטומיצין + 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית + 5 מ"מ β-גליצרופוספט
מלח חוצץ פוספט 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
מים טהורים במיוחד: מים תרבית תאים ללא פירוגן	VWR	L0970-500
חיץ כביסה			הוסף 0.05% Tween20 ל- 1x PBS.
צלחת תרבית מתלה 24 בארות	גריינר ביו-וואן	662102
סורק שטוח: Epson Perfection 1200 Photo	Epson
פיפט חד פעמי: פיפט בסרום	גריינר ביו-וואן	612301
מים מזוקקים	קרל רות'	3478.4
פיפט חד פעמי: פיפט בסרום	גריינר ביו-וואן	612301