$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. פרוטוקול צביעת כסף
- הכינו מראש את כל הפתרונות הדרושים לצביעת כסף (טבלה 1).
הערה: אין לגעת ישירות בג'ל PAGE עד שהוא מוכתם, מתפתח ומונח בתמיסת עצירה. במקום זאת, תמרן את הג'ל באמצעות כלי פלסטיק או זכוכית נקיים. טיפול ישיר בג'ל יגרום לעיוותים בטביעת האצבע ולממצאים גלויים אחרים על הג'ל לאחר הצביעה.
- לאחר סיום הריצה, יש לפרק קסטה ולחלץ ג'ל במיכל נקי, בינוני-גדול מלא במים מסוננים ונטולי יונים.
הערה: כדי להימנע מטיפול ישיר בג'ל, השתמשו בקצה פיפטה או בחפץ פלסטיק אחר כדי לקלף בעדינות את הג'ל מהקלטת בעודו שקוע במים. ג'ל עשוי להיות שביר - לטפל בזהירות.
- השליכו את המים. מכתימים את הג'ל בתמיסת צביעה כחולה של Alcian למשך 5 דקות.
- השליכו כתם כחול אלסי. יש לשטוף/לשטוף במהירות 2-3 פעמים במים מסוננים שעברו דה-יוניזציה עד להסרת רוב תמיסת הצביעה הכחולה של Alcian.
- יש להסיר את הכתמים במים מסוננים ונטולי יונים, למשך הלילה על נדנדה. ודא שיש נפח מספיק של מים מסוננים ונטולי יונים, כדי להבטיח שכל שאריות הכתם יישטפו לחלוטין מהג'ל למשך הלילה.
- יש לשטוף ג'ל ב-50% מתנול (סה"כ 40 דקות, להחליף תמיסה 2-3x).
- יש לשטוף את הג'ל במים מסוננים שעברו דה-יוניזציה למשך 30 דקות. יש להשליך את המים ולחזור על הפעולה 3 פעמים נוספות למשך שעתיים בסך הכל, ולהחליף את המים בכל פעם.
- במיכל רענן ונקי, מכתימים את הג'ל למשך 30 דקות בתמיסת צביעת כסף חנקתי.
- שטפו/שטפו במהירות 2-3 פעמים במים מסוננים נטולי יונים, כדי להסיר לחלוטין את תמיסת צביעת הכסף.
- יש לשטוף במשך 30 דקות במים מסוננים שעברו דה-יוניזציה. יש להשליך מים ולחזור על הפעולה פעמיים למשך 90 דקות בסך הכל, ולהחליף את אמבט המים בכל פעם.
- יש להשליך מים ולהוסיף תמיסת פיתוח.
- לאחר פיתוח פתרון הוא הוסיף, בזהירות לבחון את הג'ל ולצפות המראה של להקות. בהתאם לאיכות הכתם ולמסת הדגימה שהועמסה, הפיתוח יכול להימשך בין מספר שניות למספר דקות.
- ברגע שהרצועות הרצויות גלויות, יש להשליך מיד את התמיסה המתפתחת ולשטוף לזמן קצר עם תמיסת עצירה.
- יש להשליך את תמיסת העצירה, לשטוף ולהחליף בתמיסת עצירה טרייה. אפשר להשרות במשך שעה על נדנדה או שייקר.
- יש לשטוף במים מסוננים ונטולי יונים, למשך הלילה (עם זאת, ניתן לצלם את הג'ל מיד לאחר הפסקת השטיפה בתמיסה).
טבלה 1: תמיסות הדרושות לצביעת כסף של גליקוזאמינוגליקנים המופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד. יש לסנן את כל התמיסות (0.22 מיקרומטר) לפני השימוש.
| הערה: יש לסנן את כל התמיסות (0.22μm) לפני השימוש. |
| תמיסה | מתכון | הרכב | הערות |
| תמיסת צביעה כחולה אלסיאנית (500 מ"ל) | אבקת 8GX כחולה אלקיאנית | 2.5 גרם | ריכוז רצוי: 0.5% w/v |
| 2% V/V חומצה אצטית קרחונית | 500 מ"ל | |
| כתם כסף (200 מ"ל) | מים שעברו דה-יוניזציה | 192.7 מ"ל | יש להכין את תמיסת הכתמים טרי; להשתמש תוך שבוע. |
| 7.6M נתרן הידרוקסידי | 2 מ"ל | כדי להכין, להוסיף 3.04g כדורי נתרן הידרוקסיד 10 מ"ל מים |
| אמוניום הידרוקסיד | 3.3 מ"ל | |
| תמיסת כסף חנקתי 4M | 2 מ"ל | כדי להכין, להוסיף 3.397 גרם כסף חנקתי 5 מ"ל מים. הוסיפו טיפה תוך כדי ערבוב כדי למנוע משקעים. |
| פיתוח פתרון (501 מ"ל) | מים שעברו דה-יוניזציה | 500 מ"ל | פיתוח תמיסה חייב להיות טרי ולהשתמש בתוך 24 שעות. |
| 2.5% עם חומצת לימון | 1 מ"ל | כדי לעשות, להוסיף 100mg ל 4 מ"ל מים deionized. חומצת לימון חייב להיות טרי. |
| פורמלדהיד | 250μL | |
| פתרון עצירה (500 מ"ל) | מים שעברו דה-יוניזציה | 300 מ"ל | |
| חומצה אצטית קרחונית | 20 מ"ל | |
| מתנול | 90 מ"ל | |