Giemsa Staining for Colony Formation Assay: הליך צביעה חוץ גופית להערכת יכולת שגשוג של תאי גזע מזנכימליים

תקציר

מקור: Schlaefli, P. et al. שיטה אנזימטית להצלת תאי גזע מזנכימליים מדגימות מח עצם קרוש. J. Vis. Exp. (2015)

בסרטון זה, אנו מדגימים את הליך הצביעה של Giemsa כדי להעריך את פוטנציאל ההתרבות של תאי גזע מזנכימליים ליצירת מושבות בנות קיימא. כתם Giemsa הוא כתם נייטרלי המורכב בעיקר מצבעי תכלת ואוזין, הנושאים זיקה סלקטיבית לרכיבים תאיים בהתאם למטען שלהם.

פרוטוקול

1. זריעה לתרבית תאים מתרחבת וצלחות CFU

1. להשהות מחדש את התאים (המורכבים מאריתרוציטים ותאים חד-גרעיניים) ב-50 מ"ל של מדיום בסיסי: אלפא-MEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 U/ml פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין ו-2.5 מ"ג/מ"ל אמפוטריצין B. ספרו את התאים המדוללים ביחס 1:10 בתמיסת Trypan Blue באמצעות תא נויבאואר.
2. לוחצים את התאים בצלוחיות תרבית תאים בצפיפות של 5 x 10⁷ תאים לסמ"ר ודגורים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס. במידת האפשר, יש להשתמש בתנאים היפוקסיים (5% חמצן). עבור בקרת בדיקת CFU, צלחת 10⁹ תאים בצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ.
3. לאחר 3 ימים של תרבית, תאי גזע מזנכימליים מחוברים לצלחת תרבית התאים בעוד תאים אחרים נשארים בהשעיה. יש להחליף את המדיה בתווך בסיסי בתוספת גורם גדילה פיברובלסטי בסיסי (bFGF) של 5 נ"ג/מ"ל. עבור בקרת בדיקת CFU, התייחס גם לצלחת תרבית התא.
4. המשך תרבית תאים במשך 2 שבועות בסך הכל, החלפת מדיה שלוש פעמים בשבוע. אם התאים עולים על 80% מפגש, פיצול על ידי טריפסיניזציה. עבור בקרת בדיקת CFU, להחליף את המדיה באופן דומה, אבל לא לפצל את התאים במשך השבועיים.

2. כתם Giemsa עבור בדיקת CFU

1. מכינים 10 מ"ל של תמיסת גימסה בכל מנה: מדללים את תמיסת הציר (7.6 גרם/ליטר גימסה בגליצרול:מתנול) 1:10 במים סטריליים (תמיד מכינים דילול עבודה טרי).
2. הסר את המדיה מצלחת תרבית התאים ושטוף את התאים עם PBS. היזהר מאוד בעת החלת נוזל על צלחת פטרי ולהימנע משטיפת התאים.
3. תקן תאים מתנול טהור במשך 5 דקות ב RT. להשליך את מתנול. מוסיפים את תמיסת Giemsa ודגרים במשך 60 דקות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C.
4. יש לשטוף פעמיים עם PBS. יש לייבש את ראש הצלחת באוויר תחילה על מגבת נייר. ספרו את המושבות ידנית. הדבר מושג בצורה הטובה ביותר באמצעות עט טוש בגב הצלחת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
רכיבים בינוניים בסיסיים
PenStrep 100X	גיבקו	15140122
מילת נשים אנושית בסיסית	פפרוטק	100-18 ב'
MEM Alpha עם Nucleoside, עם גלוטמין יציב	אמיד	1-23S50-I
FBS חום מושבת	אמיד	2-01F36-I
אמפוטריצין ב	אפליכם	A1907
כללי
PBS	אפליכם	964.91
כתם Giemsa	אפליכם	A0885
חומרים מתכלים
צלחת cuture תא פרימריה	בז	353803
בקבוק תרבית תאים - Flask T300	TPP	90301
ציוד
סטריפט פיפטה סרולוגית 5 מ"ל	קורנינג	4487-200EA
אינקובטור לח Heracells 240	תרמו-מדעי	51026331
Heraeus Multifuge 1S-R	תרמו-מדעי	75004331